【摘要】：第一部分實(shí)驗(yàn)性房顫心房肌mRNA轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析房顫大鼠模型。并于手術(shù)前和手術(shù)10天后分別行心臟電生理檢查,包括AERP和房顫誘發(fā)性。研究背景心房顫動(dòng)(房顫,AF)是最常見(jiàn)的快速性心房電活動(dòng)紊亂,其發(fā)病率高且隨著年齡的增長(zhǎng)而倍增(85歲時(shí)達(dá)到7.1%),預(yù)計(jì)未來(lái)25年內(nèi)房顫患者將增加2倍。心房電活動(dòng)紊亂導(dǎo)致的血栓栓塞并發(fā)癥,會(huì)給患者造成極高的致殘率與致死率,因此房顫嚴(yán)重威脅患者的生命健康,降低患者的生活質(zhì)量。雖經(jīng)多年努力,但房顫的治療效果仍不令人滿意,這與其復(fù)雜的發(fā)生機(jī)制仍不為我們熟知相關(guān)。經(jīng)過(guò)多年研究,人們認(rèn)識(shí)到心房重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的重要機(jī)制,其主要包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、自主神經(jīng)重構(gòu)。心房重構(gòu)的分子機(jī)制研究及能否尋找到新的分子干預(yù)靶點(diǎn)來(lái)治療和預(yù)防房顫是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。執(zhí)行各種生命活動(dòng)的生物蛋白分子,源于遺傳密碼的精確調(diào)控。核酸分子的遺傳調(diào)控遠(yuǎn)比人類的想象復(fù)雜的多,基因組研究和基因表達(dá)調(diào)控研究為疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸機(jī)理開(kāi)辟了新篇章。研究目的本研究擬探究房顫重構(gòu)后心房肌mRNA轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的變化,確定顯著差異表達(dá)的基因,并通過(guò)生物信息學(xué)分析方法篩選在房顫重構(gòu)通路中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵分子,為房顫心房重構(gòu)發(fā)生的分子機(jī)制提供新闡釋,為房顫的優(yōu)化治療提供潛在的靶點(diǎn)。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)性房顫模型的建立選取20只健康雄性Wistar大鼠,體重在240-260 g,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和實(shí)驗(yàn)性房顫組(n=10),兩組均行手術(shù)將小動(dòng)物起搏電極置于右心房,對(duì)照組不予起搏,喂養(yǎng)10天,房顫組以15 Hz(900次/分)起搏10天建立實(shí)驗(yàn)性2.電生理指標(biāo)檢測(cè)起搏結(jié)束后,從右側(cè)頸靜脈插入標(biāo)測(cè)電極送入右心房,測(cè)定心房有效不應(yīng)期(AERP)和房顫誘發(fā)率。未能成功誘導(dǎo)心房激動(dòng)的最長(zhǎng)S1S2間期為AERP。超速電刺激(20-25 Hz)短陣施放以誘發(fā)房顫,房顫的成功誘發(fā)定義為快速不規(guī)則的心房節(jié)律持續(xù)l0s。然后,留取心房組織凍存?zhèn)溆谩?.轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析并驗(yàn)證應(yīng)用Trizol法提取對(duì)照組及房顫組各3只大鼠左心房的總RNAs,通過(guò)測(cè)序分析檢測(cè)mRNAs轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)。并隨機(jī)選取部分mRNAs轉(zhuǎn)錄本,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的方法,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。4.生物信息學(xué)分析對(duì)存在差異表達(dá)的mRNAs行Gene Ontology(GO)富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析�；诓町惐磉_(dá)基因的KEGG分析,將通路中的分子構(gòu)建樹(shù)形網(wǎng)絡(luò),尋找通路間交叉的關(guān)鍵分子。結(jié)果1.通過(guò)右心房快速起搏成功建立房顫大鼠模型。與對(duì)照組相比,房顫組AERP顯著縮短,房顫誘發(fā)率增高。2.通過(guò)房顫與非房顫大鼠左心房組織的測(cè)序分析,同時(shí)滿足表達(dá)量變化(Fold Change)≥2倍且p0.05的mRNA轉(zhuǎn)錄本共有956個(gè);其中395個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào),561個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)。隨機(jī)選取6個(gè)mRNAs轉(zhuǎn)錄本行qRT-PCR,其表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致,證實(shí)測(cè)序結(jié)果可靠。3.GO富集分析推測(cè)差異表達(dá)的mRNAs涉及到細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)水解等生物學(xué)過(guò)程;KEGG通路分析表明差異表達(dá)的mRNAs與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建、黏附分子通路及肥厚型心肌病等相關(guān)的生物學(xué)通路密切相關(guān)。根據(jù)構(gòu)建的通路分子級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),篩選出IGF1、CACNB4、ADCY5、ITGA4等通路交叉點(diǎn),這些分子可能通過(guò)多通路發(fā)揮多種生物學(xué)關(guān)鍵作用。我們選取IGF1作為房顫重構(gòu)發(fā)生機(jī)制研究的關(guān)鍵分子,行進(jìn)一步探究。結(jié)論在房顫/非房顫大鼠左心房?jī)?nèi)mRNAs轉(zhuǎn)錄本存在顯著差異性表達(dá),這些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本與房顫心房重構(gòu)密切相關(guān)。第二部分IGF1在心房顫動(dòng)大鼠心房肌纖維化中的作用研究背景心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)是心房電活動(dòng)的紊亂,是最常見(jiàn)的快速型心律失常之一,嚴(yán)重影響著患者的身心健康和生活質(zhì)量。盡管針對(duì)房顫的治療取得了諸多進(jìn)展,但房顫的治療效果依然不甚理想,這與其發(fā)生機(jī)制仍不十分明了有密切關(guān)系。結(jié)構(gòu)重構(gòu),電重構(gòu),自主神經(jīng)重構(gòu)在房顫的發(fā)生與維持中發(fā)揮重要作用。其中結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫維持和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)主要表現(xiàn)為顯著的心房間質(zhì)纖維化,且房顫的發(fā)生隨心房纖維化程度的增加而增加。心房間質(zhì)纖維化可干擾心房局部的激動(dòng)傳導(dǎo),造成單向傳導(dǎo)減慢或阻滯,增加房顫發(fā)生的可能性。徹底治療房顫是21世紀(jì)心血管領(lǐng)域的主戰(zhàn)場(chǎng):是否還有更深入的機(jī)制來(lái)闡釋房顫的發(fā)生和維持?是否還有其他干預(yù)靶點(diǎn)來(lái)預(yù)防和治療房顫?IGF1是一類具有胰島素樣代謝效應(yīng)的因子,可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡;IGF1主要在肝臟合成分泌,骨骼肌、心臟亦可合成肌肉特異性IGF1(mIGF1),通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌等形式調(diào)控下游途徑;IGF1參與到細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及機(jī)體代謝、胚胎發(fā)育、蛋白沉積與分解等過(guò)程中。研究表明,IGF-1作用于相應(yīng)受體后,其激活的信號(hào)途徑主要是兩條:通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)通路發(fā)揮作用。且研究顯示,IGF-1是一類強(qiáng)致纖維化因子,能夠上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。研究目的本研究擬探究IGF1因子對(duì)房顫大鼠心房肌纖維化的影響,揭示IGF1致纖維化的作用機(jī)制和途徑,為房顫心房重構(gòu)發(fā)生的分子機(jī)制提供新闡釋,為房顫的優(yōu)化治療提供潛在的靶點(diǎn)。材料與方法1.體外心房成纖維細(xì)胞IGF1干擾實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞活力檢測(cè)體外提取大鼠心房組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng),傳代至3-4代時(shí)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組,mIGF1過(guò)表達(dá)組,mIGF1沉默組。培養(yǎng)48 h后提取RNA,72 h后提取蛋白。并應(yīng)用CCK8試劑盒檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力。2.在體感染AAV9型腺相關(guān)病毒體外構(gòu)建AAV9型mIGF1沉默腺相關(guān)病毒。選取30只健康雄性Wistar大鼠,體重在240-260 g,隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(n= 10),植入起搏對(duì)照裝置,尾靜脈注射陰性對(duì)照腺相關(guān)病毒;起搏組(n=10),行右心房快速起搏(15 Hz),尾靜脈注射陰性對(duì)照腺相關(guān)病毒;起搏+mIGF1沉默病毒組(n=10),行右心房快速起搏(15 Hz),尾靜脈注射mIGF1沉默干擾腺相關(guān)病毒。起搏電極植入方法同第一部分。手術(shù)后通過(guò)尾靜脈注射1 × 10E11 TU的腺相關(guān)病毒。于起搏10天后停止起搏。病毒注射14天后處死動(dòng)物,取心房組織凍存行下一步實(shí)驗(yàn)。3.AERP的檢測(cè)及房顫誘發(fā)手術(shù)前及動(dòng)物處死前,應(yīng)用多通道程序刺激儀分別對(duì)陰性對(duì)照組、起搏組、起搏+mIGF1沉默病毒組行電生理檢查,測(cè)定AERP和房顫誘發(fā)性。4.分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)Trizol法提取感染后組織和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNAs,qRT-PCR方法檢測(cè)IGF1、CTGF、AT1R、COL1A1、COL3A1 的表達(dá)量;應(yīng)用 Western Blotting 方法測(cè)定IGF1、CTGF、AT1R、p/t-PI3K、p/t-Akt、Bcl2、Bax等基因蛋白的表達(dá)水平。5.免疫組化及Masson染色對(duì)CTGF、TGF-β1等指標(biāo)行免疫組化染色,測(cè)定陽(yáng)性指標(biāo)表達(dá)量;對(duì)組織切片行Masson染色,鑒定纖維化程度。結(jié)果1.對(duì)于心房成纖維細(xì)胞行mIGF1基因表達(dá)干擾,與陰性對(duì)照組比較,mIGF1過(guò)表達(dá)后,CTGF、AT1R基因的表達(dá)上調(diào),PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平上調(diào),Bc12/Bax的比值增加,細(xì)胞活力升高,COL1A1、COL3A1表達(dá)量上調(diào);反之,mIGF1低表達(dá)后,CTGF、AT1R基因的表達(dá)下調(diào),PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平下調(diào),Bc12/Bax的比值降低,細(xì)胞活力減弱,COL1A1、COL3A1表達(dá)量下調(diào)。2.相對(duì)于陰性對(duì)照組,起搏組AERP顯著降低,房顫誘發(fā)率升高;而相對(duì)于起搏組,起搏+mIGF1沉默病毒組AERP增高,但仍低于陰性對(duì)照組,房顫誘發(fā)率有所改善。3.免疫組化與Masson染色結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組比較,起搏組心房組織mIGF1表達(dá)量上調(diào),TGF-β1、CTGF 陽(yáng)性指標(biāo)含量增加,纖維化程度加重;而與起搏組比較,起搏+mIGF1沉默病毒組心房組織mIGF1表達(dá)量下調(diào),TGF-β1、CTGF陽(yáng)性指標(biāo)含量降低,纖維化程度減弱。結(jié)論1.我們發(fā)現(xiàn)mIGF1與房顫結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān),且通過(guò)功能沉默實(shí)驗(yàn)明確了mIGF1在房顫心房肌纖維化中的作用;2.mIGF1通過(guò)激活PI3K-Akt通路上調(diào)CTGF、AT1R的表達(dá)發(fā)揮致纖維化作用。創(chuàng)新性1.通過(guò)測(cè)序分析,明確了房顫重構(gòu)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜變化。2.探索mIGF1調(diào)控房顫心房肌纖維化的分子機(jī)制,有助于房顫發(fā)生與維持機(jī)制的研究,有望為房顫的防治提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn);3.借助于腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù),研究mIGF1對(duì)房顫心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響及機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R541.75

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本文編號(hào)：2772651