【摘要】：研究背景與目的:PRKAG2基因突變可導致心臟功能紊亂,典型特征是:心室預激、進展性心臟傳導功能障礙、心臟肥厚,以及心肌細胞糖原過量沉積,被定義為PRKAG2心臟綜合征,屬于糖原累積性心肌病,少數病人可出現骨骼肌異常等心臟外病變。該病雖類似肥厚性心肌病,但與之不同的是,PRKAG2心臟綜合征無肌節(jié)排列紊亂,無或少量心肌纖維化。PRKAG2心臟綜合征雖然罕見,但經家系分析顯示呈常染色體顯性遺傳,在受累家系中病患并不少見。目前,國內外報道的PRKAG2基因突變至少有16種,含1種移碼突變和15種錯義突變;絕大多數研究認為正是這些突變導致腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性改變從而引發(fā)了各種臨床病癥。不同的突變位點導致的臨床表型輕重不一,而即使是同一突變,家系成員的臨床表現也各有差別。由于心臟取材受限,既往大部分的研究都采用轉基因或基因敲入小鼠作為實驗對象,但由于存在種屬差異,研究結果備受質疑。尤其關于PRKAG2基因突變引起AMPK活性改變,一直存在升高和降低兩方面的爭議。隨著人誘導干細胞技術的日益成熟,人們可以將病人的體細胞重編程為干細胞,再分化為心肌細胞,用于疾病的機制研究;這不僅規(guī)避了種屬差異的局限,也克服了臨床取材的難題,并能為實驗研究提供足量的標本。2007年,張靜等報道了一個家族性傳導異常伴心室預激及心肌肥厚的家系;通過基因測序,發(fā)現PRKAG2基因外顯子3上(cDNA298位點)的堿基尿嘌呤G被腺嘌呤A代替,導致編碼的氨基酸(100位點)甘氨酸Gly被絲氨酸Ser代替,引起了PRKAG2心臟綜合征。雖然研究者相繼在CCL13細胞、斑馬魚及小鼠模型對該病的發(fā)病機制進行了更深入的研究,但均不能真實體現病患心肌細胞的狀態(tài)。結合當前興起的誘導干細胞技術,我們試圖從病患層面對該病進行研究。目前關于PRKAG2心臟綜合征的誘導干細胞模型的研究較少,該病具體的發(fā)病機制尚不清楚;描述該病心肌細胞糖原含量、AMPK活性、AMPKγ2表達量、細胞大小及心肌細胞功能等特征指標的研究尚不全面。本研究的目的為:建立PRKAG2心臟綜合征病患源誘導性多能干細胞定向分化心肌細胞,并進行相關的特征檢測。研究方法:(1)PRKAG2心臟綜合征家系臨床資料收集及基因檢測:共入選9人,其中家系成員6人,成員配偶3人。并采集病史、血液及尿液標本,行體格檢查及輔助檢查(包括心肌酶、心電圖、心臟彩超、動態(tài)心電圖等);提取DNA,利用多聚酶鏈式反應(PCR)擴增PRKAG2基因外顯子3行基因測序,依此結果并結合臨床表現分組,各組選1名組員的外周靜脈血做全外顯子組測序;(2)誘導性多能干細胞的培養(yǎng)及心肌細胞定向分化:分離外周靜脈血獲得外周血單核細胞或分離尿液獲得尿液脫落細胞,并擴增細胞;選用Epi5附加體iPSC重組試劑盒,采用基因非整合無飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術,將體細胞誘導、培養(yǎng)為多能干細胞(iPSCs),并對其進行驗證。隨后,采用小分子化合物分化法將iPSCs定向分化為心肌細胞(CMs),并對CMs進行鑒定;(3)病患源iPSC-CMs的特征檢測:對培養(yǎng)時間為30-90天的iPSC-CMs,通過過碘酸-雪夫(PAS)染色試劑盒定性分析細胞中的糖原含量。利用細胞免疫熒光染色,計算心肌細胞特異性表達抗體TNT或α-actinin呈陽性的iPSC-CMs表面積,統(tǒng)計分析各組細胞大小。采用Western blotting檢測各組樣品中AMPKα、p-AMPKα、AMPKγ2的含量,AMPK活性由p-AMPKα與AMPKα比值獲得。采用全細胞膜片鉗技術檢測心肌細胞的動作電位和離子通道電流。研究結果:(1)經全外顯子檢測,在Ⅲ-3的PRKAG2基因中發(fā)現2個突變位點,導致編碼的氨基酸發(fā)生改變,分別為R302Q和G100S。綜合病史、輔助檢查及外顯子3基因測序,可分為三組:病患組、家系健康組和非家系健康組。病患組包括4名家系成員Ⅱ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3和Ⅳ-2。該組基因檢測證實存在PRKAG2基因突變。除Ⅳ-2外,均有不適癥狀,如胸悶、心慌等;心臟彩超發(fā)現心肌肥厚,或心電圖提示房顫、心動過緩、束支傳導阻滯等心律失常。Ⅳ-2屬于該組中較特殊者,心電圖提示竇性心動過緩,基因檢測有突變基因,但患者目前無不適癥狀,心臟彩超未見異常。家系健康組包括2名家系成員Ⅲ-1、Ⅳ-3,無明顯不適癥狀,輔助檢查未見明顯異常,且基因檢測也無基因突變。非家系健康組包含3名成員配偶,未見明顯異常發(fā)現;(2)有5名入選者的體細胞成功誘導為iPSCs,為病患組Ⅲ-2、Ⅲ-3,家系健康組Ⅳ-3,非家系健康組Ⅲ-2妻、Ⅲ-3妻,iPSCs多能性鑒定結果為:堿性磷酸酶染色呈陽性,細胞免疫熒光染色顯示細胞表面多能性標記Oct-4、Sox-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog均呈陽性,實時熒光定量PCR顯示多能性相關基因Nanog、REX1、ESG1、DPPA2、UTF1表達均增高。iPSCs均能定向分化為CMs,并通過顯微鏡下觀察到的細胞自發(fā)性搏動,以及細胞免疫熒光染色心肌特異性蛋白TNI、TNT、α-actinin呈陽性,得以證實;(3)病患源iPSC-CMs特征檢測:PAS染色顯示,三組iPSC-CMs糖原未見明顯差異,表明病患組iPSC-CMs無明顯糖原沉積。細胞免疫熒光染色表明,病患組iPSC-CMs面積(514.1±288.2μm~2)大于家系健康組(325.0±289.2μm~2,P0.05)和非家系健康組iPSC-CMs(283.6±233.4μm~2,P0.05);證實病患組iPSC-CMs細胞增大。Western blotting結果顯示,病患組和非家系健康組iPSC-CMs的AMPK活性未見明顯差異(0.94624±0.06390和0.85370±0.03645,P=0.08),但均高于家系健康組(0.73588±0.12625,P0.05);表明病患組iPSC-CMs的AMPK活性無明顯改變。病患組AMPKγ2含量高于2健康組,表明突變的基因導致了目標蛋白表達增加。細胞膜片鉗檢測記錄到類似心室肌、心房肌動作電位,并觀察到病患組iPSC-CMs存在高鈉、高鈣通道電流(1500-2000pA),而家系健康組iPSC-CMs未觀察到該現象。研究結論:本課題成功地將PRKAG2心臟綜合征(突變位點為R302Q合并G100S)病患體細胞誘導為多能干細胞并最終定向分化為心肌細胞;證實了病患源iPSC-CMs具有PRKAG2心臟綜合征部分特征,如細胞增大、AMPKγ2表達增多、鈉鈣通道電流異常;但未見明顯糖原沉積,AMPK活性無明顯改變。本課題iPSC-CMs檢測量仍偏少;完善分化和培養(yǎng)條件以獲得足量的相對成熟的iPSC-CMs是后期研究需要解決的難題。總之,本課題誘導分化的iPSC-CMs可以作為后續(xù)研究PRKAG2心臟綜合征發(fā)病機制的一種有效模型。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

圖 1-1 2016-2017 年入選者關系圖譜-1：家系成員，女，43 歲，與先證者同輩，為Ⅱ-1 之女。無胸悶、胸厥、心慌、氣短、肌痛、肌無力，僅訴頸椎、腰椎痛。無高血壓、糖尿（圖 1-3）及動態(tài)心電圖提示竇性心律，未見異常。體檢結論：超重，比增高；心臟結構功能及彩色血流未見異常。-1 之夫：作為對照納入實驗；男，52 歲，無胸悶、胸痛、頭暈、暈厥、肌痛、肌無力。無高血壓、糖尿病史。BNP 10pg/ml（參考值 <100pg/m

- 24 -圖 1-2 兄弟二人心電圖不同表現Ⅲ-3 心電圖表現為短 PR 間期，完全性左束支傳導阻滯，左心室肥大伴勞損；Ⅲ-2 則表現為心動過緩，左心室高電壓。

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本文編號：2719853