發(fā)布時(shí)間：2020-05-26 01:56

【摘要】：低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)常見(jiàn)于多種慢性呼吸系統(tǒng)疾病和慢性高原病。它是肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension,PH)中較常見(jiàn)一種類型,以肺血管重構(gòu)及收縮為特征性病理改變。肺血管收縮引起肺動(dòng)脈壓升高,長(zhǎng)期肺動(dòng)脈壓升高導(dǎo)致肺血管重構(gòu),加重肺動(dòng)脈高壓,最后誘發(fā)右心衰竭。以往大量研究證實(shí),肺動(dòng)脈高壓形成是由多因素引起,如血管內(nèi)活性物質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁外膜成纖維細(xì)胞等參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)收縮、增殖和凋亡,然而甚少關(guān)注肺泡上皮細(xì)胞對(duì)HPH的影響。肺泡作為氣體交換的首要場(chǎng)所,肺泡上皮細(xì)胞(AEC)是呼吸膜的組成部分,是最早感知肺泡內(nèi)氧分壓變化的細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道,只有在肺泡缺氧才能引起HPH,其它類型缺氧如循環(huán)型、血液型和組織型缺氧并不引起PH,而且肺泡低氧時(shí)只有肺部動(dòng)脈壁(包括支氣管動(dòng)脈)發(fā)生重構(gòu),外周體循環(huán)動(dòng)脈壁不發(fā)生明顯的重構(gòu)�；谏厦娴睦碚�,我們認(rèn)為,低氧信號(hào)始動(dòng)的傳遞方向應(yīng)該是從AEC到肺間質(zhì)微環(huán)境,再穿過(guò)肺血管壁傳向血液。其次,健康狀態(tài)下肺泡氧分壓是105mmHg,在5000~6000m的海拔高度肺泡氧分壓在45mmHg~40mmHg,因此AEC遭受到的氧分壓變化是60mmHg~65mmHg,而動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞健康狀態(tài)時(shí)接觸的是靜脈血,混合靜脈血的氧分壓是40mmHg,即使在低氧狀態(tài)下,靜脈血氧分壓也不會(huì)低于20mmHg,所以肺血管內(nèi)皮不如AEC遭受的氧分壓變化劇烈。因此AEC是最早感知氧分壓變化和遭受氧分壓變化最劇烈的細(xì)胞,同時(shí)也是最早改變肺部微環(huán)境的細(xì)胞。另外,我們的研究結(jié)果表明,低氧肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈壓升高,主動(dòng)脈壓(體循環(huán)壓)不發(fā)生明顯的改變,處于肺微環(huán)境中的肺小動(dòng)脈和屬于體循環(huán)的支氣管動(dòng)脈發(fā)生結(jié)構(gòu)重建,而屬于體循環(huán)不在肺微環(huán)境的腎動(dòng)脈不發(fā)生重建;給予肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)和體循環(huán)血管主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(AASMCs)不同氧濃度(5%O_2、10%O_2、21%O_2)處理,PASMCs發(fā)生明顯增殖,而AASMCs增殖不明顯,說(shuō)明單純低氧不足以引起體循環(huán)血管結(jié)構(gòu)重建,肺部微環(huán)境在血管的重構(gòu)和收縮中也發(fā)揮了一定的作用。因此我們提出肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的“微環(huán)境說(shuō)”,即肺血管周圍的pH值、滲透壓、氧濃度、分泌物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的變化都會(huì)直接影響血管的結(jié)構(gòu)和功能。根據(jù)文獻(xiàn)和我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為ROS是造成肺微環(huán)境改變的主要因素之一,而在低氧情況下引起肺微環(huán)境變化的最早的根源是AEC。因此,本實(shí)驗(yàn)復(fù)制低氧條件AEC與PASMCs共培養(yǎng)細(xì)胞模型以及低氧肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)離體肺血管影響模型,從AEC的角度,改變肺血管或PASMCs微環(huán)境,以ROS中H_2O_2為切入點(diǎn),研究肺泡上皮細(xì)胞在HPH發(fā)生發(fā)展中的作用,從整體、離體血管和細(xì)胞水平探討AEC對(duì)肺血管張力和肺動(dòng)脈壁重建的影響及其機(jī)制,為HPH的發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ),為防治HPH提供新的靶點(diǎn)�！狙芯磕康摹�1、明確肺泡上皮細(xì)胞在HPH中肺血管重構(gòu)和肺血管收縮中的作用。2、以ROS中H_2O_2為切入點(diǎn),深入地探討肺泡上皮細(xì)胞在低氧性肺血管重構(gòu)和肺血管收縮中作用機(jī)制�！狙芯糠椒ā恳�、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1、成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為:常氧組(normoxia,N)、低氧組(hypoxia,H),常氧組大鼠,在常氧條件下(21%O_2)飼養(yǎng)4周;低氧組大鼠,每天在低壓低氧艙內(nèi)(10%O_2)暴露8 h,連續(xù)低氧4周。一個(gè)月后,分別檢測(cè)各組大鼠右室收縮壓(right ventricle systolic pressure,RVSP)、主動(dòng)脈壓(mCAP)、右室肥厚指數(shù)[RV/(LV+Sep)]、肺小動(dòng)脈、支氣管動(dòng)脈和腎動(dòng)脈的中膜厚度百分比(medial thickness%,MT%)及面積百分比(medial area%,MA%)等,觀察其在常氧和低氧條件下變化的差異。二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1、原代培養(yǎng)ATII、PASMCs和AASMCs,利用透射電鏡,免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光對(duì)原代培養(yǎng)的ATII、PASMCs和AASMCs進(jìn)行鑒定,同時(shí)購(gòu)買大鼠肺泡上皮細(xì)胞系RLE-6TN。2、取3-5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs在不同氧濃度條件下(21%O_2、10%O_2、5%O_2)干預(yù)48 h,MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察不同氧濃度對(duì)PASMCs和AASMCs增殖的影響。3、利用Transwell將原代培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs分別與ATII和RLE-6TN共培養(yǎng)48 h,MTT法觀察不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)條件下肺泡上皮細(xì)胞對(duì)PASMCs和AASMCs增殖的影響。4、收集原代培養(yǎng)ATII和RLE-6TN不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)上清液,MTT法觀察肺泡上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)上清液作用于PASMCs和AASMCs 48 h對(duì)其增殖影響。5、收集不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)48h原代ATII細(xì)胞,委托北京源宜基因科技有限責(zé)任公司進(jìn)行基因檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行QT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證差異基因的表達(dá)情況。6、根據(jù)基因檢測(cè)的結(jié)果,利用商業(yè)試劑盒對(duì)原代ATII細(xì)胞中的SOD活力和含量及H_2O_2進(jìn)行檢測(cè),利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)原代ATII細(xì)胞中總的ROS進(jìn)行檢測(cè),利用商業(yè)試劑盒對(duì)原代ATII細(xì)胞及其培養(yǎng)液中H_2O_2進(jìn)行檢測(cè)。7、利用不同濃度(0μM、5μM、10μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM、1000μM)外源性H_2O_2,48h后觀察對(duì)PASMCs和AASMCs增殖影響。選擇對(duì)PASMCs和AASMCs增殖影響最明顯H_2O_2濃度,觀察不同濃度ROS清除劑NAC(5mM、10mM)對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)PASMCs和AASMCs增殖影響。8、利用Transwell將原代培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs分別與ATII和RLE-6TN共培養(yǎng),加入10mM NAC后,48h后觀察PASMCs和AASMCs增殖的變化。三、離體肺血管實(shí)驗(yàn)1、分離正常大鼠和HPH大鼠肺內(nèi)三級(jí)肺小動(dòng)脈和主動(dòng)脈,制備完整的肺小動(dòng)脈(PA)環(huán)和主動(dòng)脈(AA)環(huán)。用苯腎上腺素(PE)預(yù)收縮血管環(huán),檢測(cè)血管環(huán)活性。2、收集原代培養(yǎng)ATII和RLE-6TN不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)上清,觀察對(duì)正常大鼠及HPH大鼠離體PA和AA收縮的影響。3、利用不同濃度(5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM)外源性H_2O_2觀察對(duì)正常大鼠PA和AA收縮的影響。選擇對(duì)PA和AA收縮影響最明顯H_2O_2濃度,不同濃度ROS清除劑NAC(5mM、10mM)處理后,觀察PA和AA收縮變化。4、收集原代培養(yǎng)ATII和RLE-6TN不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)上清,加入10 mM NAC后,觀察對(duì)PA和AA收縮的影響�！狙芯拷Y(jié)果】1、HPH組大鼠RVSP、RV/(LV+S)%以及肺小動(dòng)脈的MT%和MA%明顯高于正常大鼠組,而兩組大鼠mCAP卻差異不明顯;HPH大鼠組屬于體循環(huán)支氣管動(dòng)脈MT%和MA%明顯高于正常大鼠組,而兩組大鼠屬于體循環(huán)的腎血管MT%和MA%差異不明顯;同時(shí)發(fā)現(xiàn)PASMCs隨低氧程度增加增殖越明顯,而AASMCs增殖的變化不明顯。本實(shí)驗(yàn)提示PA和AA對(duì)低氧反應(yīng)差異除了和低氧有關(guān)系外,可能和其所處的微環(huán)境有關(guān)系。2、PASMCs和AASMCs分別與ATII和RLE-6TN共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)常氧條件下,ATII沒(méi)有明顯促進(jìn)PASMCs和AASMCs增殖,RLE-6TN抑制PASMCs和AASMCs增殖;低氧條件下,ATII和RLE-6TN均明顯促進(jìn)了PASMCs和AASMCs增殖。3、ATII常氧培養(yǎng)上清液對(duì)常氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖影響不明顯;RLE-6TN常氧培養(yǎng)上清液抑制常氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖。ATII和RLE-6TN常氧培養(yǎng)上清對(duì)低氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖影響不明顯;ATII和RLE-6TN低氧培養(yǎng)上清液既能促進(jìn)常氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖,也能促進(jìn)低氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖。4、ATII和RLE-6TN常氧培養(yǎng)上清液對(duì)常氧和HPH大鼠離體PA和AA收縮的影響不明顯,ATII和RLE-6TN低氧培養(yǎng)上清液促進(jìn)常氧和HPH大鼠離體PA和AA收縮。5、ATII不同氧濃度下培養(yǎng)48h測(cè)序結(jié)果及QT-PCR結(jié)果顯示,與常氧組比,低氧促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞SOD_2表達(dá),對(duì)CAT表達(dá)影響不明顯;商業(yè)試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,低氧ATII內(nèi)總SOD含量和活力、總ROS及H_2O_2含量是增加的,ATII培養(yǎng)液中H_2O_2含量也是增加的。6、觀察不同劑量外源性H_2O_2對(duì)PASMCs和AASMCs增殖情況,MTT結(jié)果顯示,0μM到50μM H_2O_2促PASMCs增殖,呈現(xiàn)劑量依賴性,而100μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制PASMCs增殖。0μM到100μM H_2O_2促進(jìn)AASMCs增殖,呈現(xiàn)劑量依賴性,而200μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制AASMCs增殖。其中50μM H_2O_2促PASMCs增殖最明顯,100μM H_2O_2促AASMCs增殖最明顯。在此濃度條件下,加入5 mM和10 mM NAC都能有效抑制H_2O_2誘導(dǎo)PASMCs和AASMCs增殖,10 mM NAC作用更明顯。7、觀察不同劑量外源性H_2O_2對(duì)PA和AA收縮情況,血管環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),5μM到400μM H_2O_2隨著劑量增加,促進(jìn)PA收縮;從600μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制PA收縮。5μM到600μM H_2O_2隨著劑量增加,促進(jìn)AA收縮;從800μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制AA收縮。其中400μM H_2O_2促PA收縮最明顯,600μM H_2O_2促AA收縮最明顯。在此濃度條件下,加入5 mM和10 mM NAC都能有效抑制H_2O_2誘導(dǎo)PA和AA收縮,10 mM NAC作用更明顯。8、ATII培養(yǎng)液中H_2O_2含量在促進(jìn)PASMCs和AASMCs增殖范圍內(nèi),也在促進(jìn)PA和AA收縮范圍內(nèi)。選擇10 mM NAC,加到PASMCs和AASMCs與ATII和RLE-6TN低氧共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中,明顯抑制PASMCs和AASMCs增殖。選擇10 mM NAC,加入到含有低氧ATII和RLE-6TN培養(yǎng)上清液浴槽中,明顯抑制PA和AA收縮。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R544.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡國(guó)昌;肺泡上皮細(xì)胞屏障功能研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè);1996年06期

2 吳中立;肺泡表面活性物質(zhì)系統(tǒng)的變化與成人呼吸窘迫綜合征[J];生理科學(xué);1988年01期

3 朱國(guó)標(biāo);王正國(guó);王聲文;唐承功;張清華;劉大維;尹友國(guó);馬孝華;;定量觀察大鼠沖擊傷時(shí)肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接冷凍蝕刻形態(tài)學(xué)變化[J];電子顯微學(xué)報(bào);1988年03期

4 支佳琦;王青青;;肺泡上皮細(xì)胞在肺部免疫中的作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2018年10期

5 陳欽桂;曾勉;;間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肺泡上皮細(xì)胞治療急性呼吸窘迫綜合征研究進(jìn)展[J];中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版);2017年02期

6 邱容;何正光;文富強(qiáng);劉代順;趙勇;;脂多糖對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞一氧化氮分泌的影響[J];西部醫(yī)學(xué);2008年03期

7 陳柏成;I型上皮細(xì)胞在ALI與ARDS形成與修復(fù)中的作用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊(cè);2004年02期

8 毛國(guó)根,葉少菁,曾群力;二氧化硅致肺泡上皮細(xì)胞連接蛋白43定位的變化[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2002年06期

9 朱國(guó)標(biāo)，，甘韶雨，張克俊，王正國(guó)，王聲文;沖擊傷時(shí)肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜內(nèi)微粒分布的變化[J];中華創(chuàng)傷雜志;1994年04期

10 倪博;白方方;韋艷娜;劉茂軍;馮志新;熊祺琰;魏建忠;邵國(guó)青;;4株豬肺炎支原體脂膜蛋白對(duì)豬肺泡上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的比較[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張捷;郝玉秋;呂雪嬌;蘇振中;王晨;白s

本文編號(hào)：2681092