【摘要】：研究背景心肌肥厚(cardiac hypertrophy)是心臟在各種機械應力或者神經激素刺激下的代償性反應,表現為心臟尺寸的增大和室壁的增厚[1,2]。在其發(fā)生的早期階段,心肌肥厚的主要原因為心肌細胞體積增大和心肌肌節(jié)數目的增多[3,4]。但隨著刺激因素的持續(xù),心肌細胞的凋亡及間質纖維化的發(fā)生從而導致心力衰竭[5]。因此心肌肥厚是多種心血管疾病共有的病理特征。β-腎上腺素受體,是G蛋白偶聯受體超家族(GPCR)的成員,廣泛的分布于心肌細胞,心臟纖維細胞及內皮細胞中[6]。β-腎上腺素受體的激活可以導致其下游的信號通路的改變從而導致心肌細胞內、心肌細胞膜以及心肌細胞纖維基質發(fā)生一系列的病理生理改變,包括心肌細胞肥大、心肌細胞纖維基質增生、心肌纖維化,最終導致心力衰竭[7,8]。在神經內分泌激活的狀態(tài)下,兒茶酚胺結合β-腎上腺素受體,從而導致G蛋白分離為Gαs/Gβγ和Gαi/Gβγ兩組亞基。Gαs亞基游離后可以激活腺苷酸環(huán)化酶從而導致第二信使c AMP的產生,從而進一步導致心率的增快及心肌收縮力的增強[9]。而Gαi亞基的可使下游PI3K/Akt和MAPK信號通路的激活從而導致心肌肥厚[10,11,12]。因此,這些潛在的靶點都為心肌肥厚的治療提供的新的方向。漢黃芩素(wogonin)是一種黃酮類化合物,分子式為C16H12O5,可從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensi Georg)、滇黃芩(Scutellaria amoena C.H.Wright)、半枝蓮(Scutellaria rivularis Wall)等植物的根部提取[13]。它具有一系列的生物學作用,如抗氧化、抗炎、神經保護及抗腫瘤[14,15,16]。近期有報導發(fā)現漢黃芩素可以改善糖尿病心肌病。而漢黃芩素是否可以逆轉腎上腺素受體激活導致的心肌肥厚及其分子機制目前還未有研究。主要研究內容:1.心肌肥厚動物模型的建立及檢驗漢黃芩素抗心肌肥厚的藥效2.離體心肌細胞肥大模型的建立和漢黃芩素抗心肌肥厚作用機制的研究3.漢黃芩素抗心肌肥厚分子靶點的探討主要試驗方法和結果:第一部分心肌肥厚動物模型的建立及檢驗漢黃芩素抗心肌肥厚的藥效材料與方法1.標本的收集和制備:(1)選用8周齡雄性ICR小鼠,持續(xù)皮下泵入藥物異丙腎上腺素(ISO,5mg/kg/day),同時給予漢黃芩素(1、10 mg/kg/day)一天一次腹腔注射,共持續(xù)2周。(2)將所有小鼠分為5組,即對照組(Control組),漢黃芩組(Wog組),異丙腎上腺素組(ISO組),低劑量漢黃芩素治療組(Wog 1mg/kg+ISO組),高劑量漢黃芩素治療組(Wog 10mg/kg+ISO組)。2.利用心臟超聲心動圖測定左心室厚度及收縮功能;處死動物后測量心臟及體重質量。3.用蘇木素-伊紅(HE)染色方法觀察心臟組織學形態(tài)。4.實時定量PCR方法檢測心臟ANP及BNP m RNA表達水平。實驗結果1.漢黃芩素逆轉ISO誘導的心臟重量的增加,盡管漢黃芩素未能阻止其體重減輕,同時單獨的漢黃芩素對體重或心臟重量沒有影響。ISO處理2周后,顯著增加HW,HW/BW,IVSd,LVPWd,LV Mass,這些都被高劑量漢黃芩素治療組逆轉。但射血分數(EF)在各組間未有統(tǒng)計學差異。2.心臟HE染色同樣也提示,同ISO相比,高劑量漢黃芩素治療組可以顯著改善心臟的大小及心肌纖維的橫截面積。3.單獨使用漢黃芩素不影響心臟ANP和BNP m RNA水平,但能逆轉ISO處理后小鼠心肌組織中ANP、BNP的m RNA表達的升高。小結漢黃芩素可以改善異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚。第二部分離體心肌細胞肥大模型的建立和漢黃芩素抗心肌肥厚作用機制的研究材料與方法1.選用ISO(10μM)體外刺激大鼠心肌細胞系(H9C2)建立離體心肌細胞肥大模型。治療組漢黃芩素(1μM,10μM)與ISO共孵育24 h。2.實時定量PCR方法檢測H9C2細胞的ANP及BNP的m RNA表達水平。3.α-SMA免疫熒光觀察H9C2細胞形態(tài)。4.Western blot檢測p-Akt,Akt,p-CREB,CREB,p-JNK,JNK,p-p38 MAPK,p38 MAPK,p-ERK1/2,ERK1/2蛋白表達水平。5.Wog、ISO、渥曼青霉素(wartmannin)共處理H9C2 24 h,用Western blot方法,檢測p-Akt,Akt,p-Fox O1,Fox O1,p-Fox O3a,Fox O3a,p-CREB和CREB的蛋白表達。實驗結果1.正常對照組相比,ISO(10μM)可顯著升高ANP、BNP的m RNA表達水平。高劑量漢黃芩素組(10μM)可顯著改善ISO導致的ANP及BNP表達水平的升高。2.免疫熒光α-SMA檢測提示ISO刺激可使H9C2細胞體積明顯增大,而漢黃芩素可以使其逆轉。3.使用ISO刺激后可使Akt、CREB、JNK、p38及ERK的磷酸化水平顯著升高,而使用漢黃芩素治療后只能逆轉Akt和CREB的磷酸化水平。為驗證PKC信號通路,我們使用了PKC信號通路的激動劑,PDBU(5μM)和漢黃芩素(10μM)共孵育24 h后,檢測ANP及BNP的m RNA水平,發(fā)現漢黃芩素不能逆轉PDBU導致的ANP及BNP的升高。4.在ISO的作用下CREB的磷酸化同時受c AMP/PKA和PI3K/Akt兩條信號通路的調節(jié),而漢黃芩素未能改善DB-CAMP導致的CREB的磷酸化的改變,提示漢黃芩素減少CREB的磷酸化是通過PI3K/Akt信號通路。5.漢黃芩素可以抑制ISO導致的Akt及其下游Fox O1,Fox O3a和CREB的磷酸化升高,同時合用漢黃芩素和wartmannin,未能使Akt及其下游的磷酸化水平進一步降低,證實漢黃芩素的作用靶點位于PI3K/Akt信號通路。小結漢黃芩素通過抑制PI3K/Akt通路,改善異丙腎上腺素誘導H9C2心肌肥大。第三部分漢黃芩素抗心肌肥厚分子靶點的探討材料與方法1.分別轉染持續(xù)性激活的AKT(constitutively active Akt,AKT(CA))及Pik3ca質粒至H9C2心肌細胞24 h后,漢黃芩素(10μM)與其共孵育24 h,Western blot檢測Pik3ca,p-Akt,Akt,p-Fox O1,Fox O1,p-Fox O3a,Fox O3a,p-CREB和CREB的蛋白表達。2.轉染Pik3ca質粒至H9C2心肌細胞24 h后,漢黃芩素(10μM)與其共孵育24 h,用免疫熒光α-SMA染色方法觀察H9C2心肌細胞的形態(tài)學變化。3.H9C2心肌細胞使用ISO(10μM)及漢黃芩素(10μM)共處理24 h,在最后8h加入MG132共孵育,Western blot檢測Pik3ca及ubiquitin的蛋白表達,實時定量PCR方法檢測H9C2細胞中Pik3ca m RNA的表達水平。在H9C2細胞中轉染HA-tagged Pik3ca,隨后加入漢黃芩素及MG132處理,使用HA-beads做免疫共沉淀,應用Western blot檢測HA及ubiquitin的蛋白表達水平。4.使用ISO(10μM)及漢黃芩素(10μM)共同處理H9C2心肌細胞24 h,用Westernblot及實時定量PCR檢測Nedd4l的蛋白及m RNA表達水平。轉染Flag-Nedd4l質粒至H9C2中,隨后加入Wog處理,應用Western blot檢測Flag-Nedd4l水平。轉染p GL3--2000/+1LUC Nedd4l質粒至H9C2中,隨后加入漢黃芩素處理,檢測熒光素酶報告基因的表達。實驗結果1.Akt(CA)顯著激活了下游Fox O1,Fox O3a和CREB的磷酸化,而漢黃芩素不能抑制其表達。漢黃芩素可通過抑制Pik3ca的表達抑制PI3K/Akt信號通路。2.ISO可以顯著升高Pik3ca的蛋白及m RNA表達水平,而漢黃芩素減少了Pik3ca的蛋白水平而不能使其的m RNA水平降低,提示Wog加快了Pik3ca的降解。3.利用MG132處理H9C2,漢黃芩素導致蛋白泛素化的增加,同時MG132逆轉Wog導致的Pik3ca的降解。HA-tagged Pik3ca質粒轉入H9C2,隨后使用Wog和MG132處理,免疫共沉淀提示漢黃芩素是通過增加Pik3ca的泛素化加速其降解。4.異丙腎上腺素降低H9c2細胞中Nedd41的m RNA和蛋白質表達水平。漢黃芩素可在轉錄和轉錄后水平逆轉異丙腎上腺素對Nedd4l表達的抑制作用。我們通過瞬時轉染在H9c2細胞中高表達Flag-Nedd4l,發(fā)現漢黃芩素不影響外源Nedd4l的蛋白質表達水平。熒光素酶報告基因檢測提示漢黃芩素顯著增強Nedd4l啟動子熒光素酶活性。小結漢黃芩素提高心肌細胞Nedd4l的表達,Nedd4l增強Pik3ca的泛素化并促進Pik3ca蛋白被降解,最終抑制PI3K/Akt通路信號轉導�？偨Y本研究揭示,漢黃芩素特異性的提高心肌細胞中Nedd41的表達,由此促進其底物Pik3ca的泛素化降解,抑制PI3K/Akt信號通路及減少肥大基因的表達,從而改善異丙上腺素導致的心肌肥厚。
【圖文】：

臟超聲檢測左室間隔厚度(IVSd)、左室后壁厚度(LVPWd)，左室舒展末期內徑(LVIDd)及左室收縮末期內徑(LVIDs)，射血分數 (EF (%)) 及左室重量指數（LVMass）。如表2及圖2所示，較正常對照組組，ISO組的IVSd、LVPWd及LVMass均明顯增加（0.89±0.02 vs 0.72±0.02，P<0.05；0.88±0.03 vs 0.75±0.01，P<0.05；111.07±2.13 vs 100.22±2.07，P<0.05）。而Wog（10 mg/kg）+ISO治療組，能有效的逆轉ISO導致的IVSd、LVPWd及LVMass的增加（0.76±0.02 vs 0.89±0.02，P<0.05；0.81±0.02 vs 0.88±0.03，P<0.05；103.21±3.11 vs 99.43±1.35

被認為是心肌肥厚的重要標志[29]。本研究中使用qPCR證實，ISO明顯升高了小鼠心肌細胞的ANP及BNP的mRNA水平，而漢黃芩素可以逆轉ISO導致的心肌肥厚標志基因表達的升高,差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖3）。而單用漢黃芩素對ANP及BNP mRNA水平未有明顯影響（P>0.05）。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.2

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本文編號：2623309