【摘要】：心血管疾病是全球因疾病引起死亡的首要原因,嚴(yán)重危害人類健康。心血管的發(fā)生發(fā)育涉及到復(fù)雜的分子機(jī)制,許多遺傳機(jī)制尚不明確。尋找致病基因、探究致病機(jī)理并提供可能的治療措施是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的意義所在。本文分兩個(gè)部分分別探索了Wdpcp基因?qū)跔顒?dòng)脈發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制和表觀遺傳藥物反苯環(huán)丙胺(TCP)糾正心臟流出道畸形的治療效應(yīng)。Wdpcp基因是平面細(xì)胞極性的效應(yīng)基因,在胚胎時(shí)期通過(guò)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和初級(jí)纖毛生長(zhǎng)參與到多種臟器的發(fā)生發(fā)育過(guò)程,其純合突變小鼠(Wdpcp~(m/m))呈現(xiàn)無(wú)眼,多趾,腸囊腫,腎囊腫,肺動(dòng)脈閉鎖,房室間隔缺損等一系列畸形,類似臨床上的Bardet Biedl和Meckel Gruber綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)Wdpcp基因?qū)τ诠跔顒?dòng)脈的發(fā)育亦不可或缺。通過(guò)SM22α示蹤冠脈平滑肌細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)Wdpcp純合突變小鼠的冠狀動(dòng)脈分支減少,平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯下降,而冠狀靜脈的發(fā)育基本不受影響。PECAM免疫組化染色顯示W(wǎng)dpcp基因缺失并不影響冠脈血管叢的形成,相比野生型小鼠血管叢的形成速度反而加快。采用Wt1~(CreERT2)-Rosa26~(mTmG)系統(tǒng)示蹤心外膜細(xì)胞,結(jié)果顯示W(wǎng)dpcp純合突變小鼠胚胎的心外膜來(lái)源細(xì)胞(EPDCs)相比野生型小鼠顯著減少,qPCR分析顯示Snail2,Twist1等EMT調(diào)節(jié)基因和Vinculin,Vimentin等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)明顯降低。3D膠原凝膠實(shí)驗(yàn)證明Wdpcp純合突變小鼠的EPDCs其遷移能力相比野生型小鼠明顯下降。進(jìn)一步在小鼠中特異性敲除心外膜細(xì)胞的Wdpcp基因,其冠脈缺陷表型與Wdpcp純合突變小鼠相似。以上結(jié)果證明Wdpcp通過(guò)促進(jìn)心外膜細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和遷移過(guò)程在冠脈血管叢的重塑階段發(fā)揮作用。本研究首次呈現(xiàn)了一個(gè)在冠脈血管叢重塑而非形成過(guò)程中發(fā)生缺陷的小鼠模型,將為冠脈血管叢重塑過(guò)程中的分子機(jī)制研究提供幫助。22q11.2微缺失綜合征(22q11.2DS)是臨床上最常見的染色體微缺失綜合征,常見臨床癥狀有心血管畸形、頭面部畸形、胸腺/甲狀旁腺發(fā)育不良等,其中心血管畸形主要表現(xiàn)為法氏四聯(lián)征、法氏四聯(lián)征合并肺動(dòng)脈閉鎖,另外的類型有主動(dòng)脈弓離斷、右室雙出口和永存動(dòng)脈干等。其致病基因主要是由于T盒轉(zhuǎn)錄基因TBX1的單倍體不足。我們的合作者Baldini教授實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Tbx1可通過(guò)招募甲基化轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)組蛋白3賴氨酸4的單甲基化(H3K4me1)從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在此工作基礎(chǔ)上,我們以Tbx1~(LacZ/+)、Tbx1~(Neo2/LacZ)突變小鼠為研究對(duì)象,檢測(cè)組蛋白去甲基化酶抑制劑TCP能否糾正Tbx 1缺失造成的心血管畸形。腹腔注射TCP,收取胚胎10.5天Tbx1~(LacZ/+)突變小鼠,通過(guò)墨汁注射觀察第Ⅳ咽弓動(dòng)脈形態(tài),發(fā)現(xiàn)其缺陷比例下降;收取胚胎18.5天Tbx1~(Neo2/LacZ)突變小鼠,觀察心臟流出道形態(tài),發(fā)現(xiàn)TCP可部分糾正永存動(dòng)脈干畸形,但并不能糾正胸腺缺失的表型。qRT-PCR分析顯示Tbx1的表達(dá)量在TCP處理組和PBS對(duì)照組無(wú)顯著差別,說(shuō)明TCP并非通過(guò)上調(diào)Tbx1基因本身的表達(dá)量起作用。原位雜交實(shí)驗(yàn)證明TCP處理后第二心域細(xì)胞(SHF)Fgf8的表達(dá)增加,與該結(jié)果一致的是,增殖相關(guān)基因Cyclin D2在SHF細(xì)胞表達(dá)增加,增殖相關(guān)蛋白PHH3磷酸化水平提高。且TCP處理后SHF極性缺失程度減輕,αPKCζ熒光信號(hào)重新趨向細(xì)胞頂端分布。本研究為表觀遺傳藥物TCP可糾正Tbx1單倍劑量不足效應(yīng)的理論提供了強(qiáng)有力的體內(nèi)證據(jù),為臨床上22q11.2微缺失綜合征提供一種新的潛在的治療策略。
【圖文】：

Wdpcp 在心外膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和心臟免疫細(xì)胞中均有表達(dá)[75]（圖1A, 1B）。利用原位雜交的方法進(jìn)一步證明在胚胎 13.5 天的小鼠心臟 Wdpcp 的表達(dá)非常廣泛（圖 1C）。

圖 2B-2D 中黑色箭頭示 LCA 的 X-gal 染色變淺，圖2B 和 2C 中紅色箭頭所示冠狀動(dòng)脈主干上染色中斷。而冠狀靜脈（LCV）在突變體中相較于對(duì)照組受影響較�。▓D 2B-2D）。采用 Image Pro Plus 軟件定量三對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組胚胎心臟的冠脈平滑肌細(xì)胞在冠脈中的覆蓋率，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組冠狀動(dòng)脈中其平滑肌細(xì)胞覆蓋率顯著低于對(duì)照組，而在冠狀靜脈中平滑肌細(xì)胞覆蓋率在兩組中無(wú)差別（圖 2E）。同時(shí)在突變體中注意到會(huì)有異常的短小冠狀動(dòng)脈起源于主動(dòng)脈的一側(cè)（圖 2B-2D 的黃色箭頭所示）。為了檢測(cè)冠狀動(dòng)脈室間隔支在突變體中是否形成異常，將心臟放在 1：1 的苯偶酰苯甲酸和水楊酸甲酯中進(jìn)行透明處理，可以很清楚地看到對(duì)照組小鼠的冠狀動(dòng)脈室間隔支，，而在突變體中卻未觀察到（圖 2G，2H）。以上結(jié)果顯示 Wdpcp 在冠狀動(dòng)脈形成過(guò)程中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.3

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本文編號(hào)：2623117