【摘要】：內(nèi)膜增生是血管受損后普遍出現(xiàn)的病理現(xiàn)象,是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié),同時也是搭橋手術(shù)、冠脈內(nèi)支架術(shù)后血管再狹窄的重要原因。具體來說,內(nèi)膜增生是血管內(nèi)膜的增厚。正常情況下,血管內(nèi)膜主要成分僅為內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮下層;其中內(nèi)皮下層僅含有少量膠原纖維、彈性纖維,有時有少許平滑肌細胞。內(nèi)膜增生機制復(fù)雜,內(nèi)皮細胞受損,平滑肌細胞增殖遷移,細胞外基質(zhì)降解和重新合成,脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)都參與到該過程中。目前,抑制和治療內(nèi)膜增生的方法有限,研究其機制和病理過程將有利于找到有效的治療方法。Tiam1屬于鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子(GEF)家族,主要是小G蛋白Rac1的調(diào)節(jié)蛋白,激活Rac1的信號通路。Tiam1參與成纖維細胞、神經(jīng)細胞、腫瘤細胞的細胞骨架重排、細胞遷移、內(nèi)吞和增殖等過程。PDGF能激活細胞內(nèi)Tiam1。另外,已有研究發(fā)現(xiàn)不表達ephrin-B2的小鼠其Tiam1-Rac1信號通路活性下降,伴有血管壁缺損和動脈瘤的形成。說明Tiam1對血管的結(jié)構(gòu)可能有重要作用,但是目前尚沒有研究發(fā)表關(guān)于Tiam1與平滑肌細胞及內(nèi)膜增生之間的直接關(guān)系。我們的研究通過不表達Tiam1蛋白的小鼠單側(cè)頸內(nèi)動脈結(jié)扎模型,顯示Tiam1敲除能減少動脈內(nèi)膜增生,并且揭示其相關(guān)的具體機制。本論文主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面:1.Tiam1在平滑肌細胞中的表達(i)目的:探討Tiam1在血管平滑肌細胞中的表達(ii)方法:原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞,分為siCtl組、siCtrl+PDGF(20ng/ml)組、siTiam1組、siTiam1+PDGF(20ng/ml)組,在PDGF刺激0、12、24h后,免疫印跡方法分析Tiam1蛋白表達變化。(iii)結(jié)果sictrl組的vsmc會表達tiam1,在sictrl+pdgf組,tiam1的表達量增高,與sictrl組相比,sitiam1組tiam1的表達量明顯減少甚至消失。加入pdgf刺激12及24h后,tiam1表達量明顯增加。(iv)結(jié)論血管平滑肌細胞中表達tiam1蛋白。并且pdgf刺激后能促進tiam1的表達。2.tiam1對血管平滑肌細胞遷移的影響(ⅰ)目的:探討tiam1對血管平滑肌細胞遷移功能的影響。(ⅱ)方法:原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞,分四組進行轉(zhuǎn)染:sictr組、sictr+pdgf(20ng/ml)組、sitiam1組、sitiam1+pdgf(20ng/ml)組。對四組細胞分別進行劃痕實驗,觀察平滑肌細胞遷移功能的改變。(ⅲ)結(jié)果:細胞劃痕實驗中sitiam1組在12小時劃痕遷移面積比例均小于sictr組(p0.05)。但是24小時及加入pdgf刺激以后,sictrl組和sitiam1敲除組未見明顯差異。(ⅳ)結(jié)論:tiam1缺乏能夠在一定程度和一定時間內(nèi)抑制平滑肌細胞的遷移能力。3.tiam1對平滑肌細胞增殖與凋亡功能的影響(i)目的探討tiam1對平滑肌細胞增殖與凋亡的影響(ii)方法原代培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞,分為陰性對照組,轉(zhuǎn)染組,其中轉(zhuǎn)染組分為sictrl組及sitiam1組,兩組轉(zhuǎn)染組當中分別又分為予以饑餓液(0.4%fbs培養(yǎng)基)組及完全培養(yǎng)基組(20%fbs培養(yǎng)基)。予以annexin-fitc/pi染色流式細胞儀技術(shù)檢測細胞凋亡,edu染色檢測細胞增殖。(iii)結(jié)果(a)流式細胞儀技術(shù)檢測示,sictrl組及sitiam1組均存在大量晚期凋亡細胞,兩者無明顯差異。(b)edu染色顯示,sitiam1組與sictrl組相比,edu陽性細胞數(shù)量明顯減少。(iv)結(jié)論tiam1缺乏抑制能明顯抑制平滑肌細胞的增殖能力,對凋亡無明顯作用。4.tiam1在血管平滑肌細胞中對pi3k/akt、mapk/p38信號通路的影響(i)目的探討tiam1在血管平滑肌細胞中對pi3k/akt、mapk/p38通路的影響(ii)方法原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞,分2組,分別轉(zhuǎn)染sictrl及sitiam1,每組中分6小組,轉(zhuǎn)然后分別加pdgf刺激0、5、15、30、60、90分鐘。提取細胞蛋白,免疫印跡法分析p-akt、p-p38變化水平。(ⅲ)結(jié)果:westernblotting結(jié)果顯示:1)sitiam1+pdgf(30min)組、sitiam1+pdgf(60min)組和sitiam1+pdgf(90min)組中p-akt的表達較sictr+pdgf(30min)組、sictr+pdgf(60min)組和sictr+pdgf(90min)明顯減少(p0.05);2)sitiam1+pdgf(5min)組、sitiam1+pdgf(15min)組中p-p38的表達較sictr+pdgf(5min)組、sictr+pdgf(15min)組明顯減少(p0.05)。(ⅳ)結(jié)論:tiam1可能通過pi3k/akt、mapk/p38信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)參與內(nèi)膜增生的形成。5.tiam1對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響(ⅰ)目的:探討tiam1對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響。(ⅱ)方法:(a)利用pcr、核酸電泳、基因測序?qū)iam1小鼠進行基因分型篩選出wt小鼠和ko小鼠,對其進行分組。(b)wt組和ko組小鼠各5只,行左側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù),術(shù)后24天取雙側(cè)頸動脈,對血管進行石蠟切片。對wtligated組、wtsham組koligated組、kosham組頸動脈進行he染色,觀察及測量內(nèi)膜(i)、中膜面積(m)及外膜面積(adv),計算i/m比值,并對其進行統(tǒng)計學(xué)比較。(ⅲ)結(jié)果:(a)根據(jù)基因測序圖分析,發(fā)生雙突變的為KO,單突變?yōu)殡s合子,未發(fā)生突變?yōu)閃T(b)HE染色結(jié)果顯示,頸動脈結(jié)扎24天后,小鼠手術(shù)側(cè)頸動脈內(nèi)膜明顯增厚,KO ligated組內(nèi)膜面積明顯小于WT ligated組內(nèi)膜面積(P0.05);KO ligated組I/M比值明顯小于WT ligated組(P0.05);KO ligated組和WT ligated組中膜及外膜面積無明顯差異。(ⅳ)結(jié)論:Tiam1敲除會減少頸動脈內(nèi)膜增生。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2552471