【摘要】：延遲整流鉀電流(IK)是哺乳動(dòng)物和人的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極主要的外向鉀電流,按照通道動(dòng)力學(xué)特征將IK區(qū)分為快激活(IKr)和緩慢激活I(lǐng)Ks)兩種成分。其中,IKs通道的孔區(qū)α-亞單位由KCNQ1基因編碼、β-亞單位由KCNE1基因編碼。現(xiàn)已明確,先天性KCNQ1和KCNE1基因突變可致IKs增大或減小,分別引發(fā)長(zhǎng)QT綜合征(LQT)和短QT綜合征(SQT)。心臟疾病如心肌缺血、心肌肥厚、慢性心力衰竭等均伴隨IKs的減小,表現(xiàn)為獲得性LQT。LQT和SQT均以高發(fā)室性心律失常為特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)節(jié)具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明,催化磷酸化反應(yīng)的蛋白磷酸激酶C(protein kinase C,PKC)家族與KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)控相關(guān),但迄今關(guān)于PKC對(duì)IKs的調(diào)節(jié)報(bào)道不盡相同,有增加和減小兩種相反的結(jié)果。已知PKC家族按照結(jié)構(gòu)和激活方式的不同可以分為傳統(tǒng)型PKC(c PKC,包括α、βI、βII和γ),新型PKC(n PKC,包括δ、ε、π和θ)和非典型PKC(a PKC,包括ζ、i/λ)三大類,而不同動(dòng)物種屬的心肌組織均存在PKCα、βI、βII、e、θ、δ、γ等亞型。很可能上述PKC對(duì)IKs的不同調(diào)節(jié)現(xiàn)象是因?yàn)榧せ畹腜KC亞型不同所致。離子通道電流的大小取決于通道孔的通透性、開放概率以及細(xì)胞膜上通道數(shù)量,調(diào)節(jié)后者的因素涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及降解等環(huán)節(jié)。其中蛋白的正向轉(zhuǎn)運(yùn)與降解平衡是決定細(xì)胞膜上通道數(shù)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前,不同PKC亞型如何調(diào)控細(xì)胞膜通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與降解從而影響細(xì)胞膜上通道數(shù)量尚不清楚。因此,本研究主要在分子生物學(xué)水平,利用非選擇性PKC激動(dòng)劑和連接透膜序列的選擇性PKC激動(dòng)肽,在異源表達(dá)系統(tǒng)上研究不同PKC亞型對(duì)細(xì)胞膜上KCNQ1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用,并且探究其調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。這對(duì)理解心肌離子通道的病理重構(gòu)機(jī)制具重要意義,也將為發(fā)現(xiàn)以PKC亞型為靶點(diǎn)的新型抗心律失常藥物提供重要的理論依據(jù)。第一部分不同PKC亞型對(duì)KCNQ1蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)作用。目的:在構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)KCNQ1/KCNE1通道的HEK293細(xì)胞系上,研究不同PKC亞型對(duì)KCNQ1總蛋白、細(xì)胞膜蛋白表達(dá)水平的影響。方法:1全細(xì)胞蛋白提取:細(xì)胞漂洗后輕輕刮下并離心,收集細(xì)胞沉淀,按照RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑(PMSF)以100:1的比例加入并使細(xì)胞沉淀充分混懸,冰上超聲破碎后靜置裂解,離心收集上清液。2細(xì)胞膜蛋白提取:利用生物素�；姆椒�(biāo)記細(xì)胞膜蛋白,充分裂解破碎細(xì)胞后,借助珠子特異性結(jié)合的方式將生物素標(biāo)記的膜蛋白分離,其余成份離心丟棄,再經(jīng)洗脫,得到純凈的細(xì)胞膜蛋白成份。3 Western blot:對(duì)提取的全細(xì)胞蛋白或者細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用TBST配制含10%脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉,通過特異性的一抗與紅外熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合,用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器進(jìn)行曝光成像。4 si RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:采用Lipofectin RNAmax試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,鋪板后24小時(shí),細(xì)胞匯合度達(dá)到50%-60%時(shí)可進(jìn)行si RNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4小時(shí)左右后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后,si RNA表達(dá)完成,可進(jìn)行下一步處理。結(jié)果:1不同PKC亞型對(duì)全細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)水平的影響:利用非選擇性PKC激動(dòng)劑PMA(100 n M)、OAG(10μM)和選擇性c PKC激動(dòng)肽(200 n M)、PKCε激動(dòng)肽(200 n M)分別孵育24小時(shí),Western blot檢測(cè)全細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)沒有明顯變化(P0.05)。2不同PKC亞型對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平的影響:首先,驗(yàn)證細(xì)胞膜蛋白提取方法的敏感性。采用陽性對(duì)照藥地塞米松(50 n M)(已被證實(shí)通過抑制蛋白泛素化降解,顯著增加細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平)孵育6、24小時(shí)后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照的176%(P0.05)和281%(P0.05),證明實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞膜蛋白提取方法敏感性較好。PMA、OAG以及c PKC激動(dòng)肽、PKCε激動(dòng)肽分別與細(xì)胞孵育6、24小時(shí),Western blot檢測(cè)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,PMA孵育后細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照的36%(P0.01)和24%(P0.01);c PKC激動(dòng)肽孵育后,細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照的24%(P0.01)和30%(P0.01);PKCε激動(dòng)肽孵育后細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平是對(duì)照的34%(P0.01)和34%(P0.01);而OAG孵育后,細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P0.05)。3 si RNA敲低不同PKC亞型對(duì)激動(dòng)肽作用的影響:利用si RNA干擾技術(shù),敲低不同PKC亞型表達(dá),觀察對(duì)上述PKC亞型激動(dòng)肽作用的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證其作用的特異性。結(jié)果顯示,敲低細(xì)胞PKCa和β亞型可逆轉(zhuǎn)c PKC激動(dòng)肽下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的作用(P0.05),未敲低為對(duì)照的48%,而敲低PKCa和β亞型后為對(duì)照的94%。與此相似,敲低PKCε亞型后PKCε激動(dòng)肽對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用顯著減弱(P0.01),未敲低為對(duì)照的33%,而敲低PKCε亞型后為對(duì)照的68%。因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明PKC亞型特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的作用。小結(jié):在異源表達(dá)系統(tǒng)上,PMA、c PKC和PKCε激動(dòng)肽對(duì)全細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)無明顯影響,而對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)明顯下調(diào)作用,提示PKC通過調(diào)節(jié)通道的轉(zhuǎn)運(yùn)與降解過程影響細(xì)胞膜上的通道表達(dá)水平。第二部分不同PKC亞型對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1表達(dá)調(diào)節(jié)作用的機(jī)制目的:探究激活c PKC亞型和PKCε亞型后下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。方法:觀察選擇性干擾細(xì)胞膜通道蛋白內(nèi)吞、降解和正向轉(zhuǎn)運(yùn)過程的工具藥對(duì)PKC亞型激動(dòng)肽作用的影響,分析激活不同PKC亞型對(duì)上述過程的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞膜蛋白提取和Western blot方法同第一部分。結(jié)果:1對(duì)細(xì)胞膜蛋白內(nèi)吞過程影響:觀察內(nèi)吞抑制劑Dynasore(80μM)對(duì)激活不同PKC亞型作用的影響。結(jié)果顯示,PMA與Dynasore共同孵育6小時(shí)后對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用被明顯抑制(P0.01),單獨(dú)孵育表達(dá)水平為對(duì)照的34%,而共同孵育為對(duì)照的89%;與此相似,c PKC激動(dòng)肽與Dynasore共同孵育對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用同樣被明顯抑制(P0.01),單獨(dú)孵育表達(dá)水平為對(duì)照的24%,而共同孵育為對(duì)照的89%。上述結(jié)果表明PMA和c PKC激動(dòng)肽通過促進(jìn)馬達(dá)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑使細(xì)胞膜KCNQ1蛋白加速降解而發(fā)揮下調(diào)作用。與此相反,PKCε激動(dòng)肽與Dynasore共同孵育對(duì)KCNQ1細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的下調(diào)作用未受影響(P0.05),單獨(dú)孵育表達(dá)水平為對(duì)照的29%,而共同孵育表達(dá)水平為對(duì)照的39%,提示PKCε激動(dòng)肽并非通過影響內(nèi)吞過程減少細(xì)胞膜KCNQ1表達(dá)水平。此外,單獨(dú)孵育Dynasore并不明顯改變細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平,可能是其他代償?shù)姆绞綇浹a(bǔ)了馬達(dá)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑阻斷所帶來的影響。2對(duì)細(xì)胞膜蛋白降解的影響:加入正向轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑Brefeldin A(BFA)(10μM)后利用Western blot檢測(cè)不同時(shí)間細(xì)胞膜上KCNQ1蛋白表達(dá)水平,可以反映出通道細(xì)胞膜蛋白降解速度。結(jié)果顯示,以各自0小時(shí)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平為100%,BFA對(duì)照組孵育6、24小時(shí)分別是0小時(shí)的72%和39%,c PKC激動(dòng)肽共孵育分別是30%和14%,與對(duì)照相比降解顯著增多(P0.01);而PKCε激動(dòng)肽共孵育分別是68%和33%,降解程度與對(duì)照相比無明顯差別(P0.05)。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了激活c PKC亞型通過加速內(nèi)吞降解過程下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平,而激活PKCε亞型對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用則可能是通過抑制蛋白正向轉(zhuǎn)運(yùn)或者再循環(huán)過程而實(shí)現(xiàn)的。與此類似,我們也觀察了PMA對(duì)蛋白降解的影響。結(jié)果顯示,BFA對(duì)照組孵育后細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是0小時(shí)的82%和32%,而PMA共孵育分別是45%和14%,兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的降解程度均顯著高于對(duì)照(P0.01),表明PMA也通過加速內(nèi)吞降解過程來下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示盡管PMA為非選擇性PKC激動(dòng)劑,但其作用機(jī)制與c PKC亞型相似,可能在此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)PMA主要通過激活c PKC亞型下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平。小結(jié):PMA和c PKC激動(dòng)肽加速了通道細(xì)胞膜蛋白的內(nèi)吞降解,而PKCε激動(dòng)肽則可能抑制了蛋白正向轉(zhuǎn)運(yùn)或者再循環(huán)過程降低細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)量。結(jié)論:在異源表達(dá)系統(tǒng)上,c PKC與PKCε亞型均可顯著降低細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平,其機(jī)制是c PKC亞型加速蛋白內(nèi)吞、降解過程,而PKCε亞型不影響此過程,可能是其抑制蛋白正向轉(zhuǎn)運(yùn)或者再循環(huán)過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2319795