本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化影響乙醛脫氫酶2（ALDH2）心肌缺血保護(hù)作用的基礎(chǔ)研究

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【摘要】：乙醛脫氫酶2(ALDH2)是一種核編碼酶,主要作用是在線粒體基質(zhì)內(nèi)催化能量代謝過(guò)程中生成的醛類產(chǎn)物氧化,并生成對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸。近幾年研究已證實(shí)ALDH2在心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),而且ALDH2在包括心肌缺血在內(nèi)的多種心肌損傷模型中均具有顯著的心肌保護(hù)作用。心肌缺血時(shí),ALDH2催化毒性醛類4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)形成無(wú)毒的有機(jī)酸,從而阻斷4-HNE 相關(guān)的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)軸,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),阻斷下游由HSP70/JNK/p53介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,最終發(fā)揮心肌缺血保護(hù)作用。另一方面,研究顯示在心肌缺血過(guò)程中,心肌ALDH2含量降低,而給予外源性ALDH2補(bǔ)充會(huì)減少心肌缺血損傷。但是,如何解釋“缺血心肌ALDH2表達(dá)降低”這一現(xiàn)象,研究者尚沒(méi)有滿意的研究證據(jù)。表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)指的是：在不改變DNA堿基序列的前提下,進(jìn)行的染色質(zhì)層面的修飾及調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方式包括組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼RNA干預(yù)(如micro RNA)。其中DNA甲基化(DNA methylation)可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平,其經(jīng)典作用位點(diǎn)為DNA序列中的胞嘧啶(C)與鳥(niǎo)嘌呤(G)形成CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu),該位點(diǎn)DNA在甲基化處理后,其中的C形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。一般來(lái)說(shuō),基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化會(huì)降低其轉(zhuǎn)錄水平。而在心血管疾病領(lǐng)域,許多研究顯示DNA甲基化可以影響先天性心臟病、心肌病及冠心病等多種心血管疾病。我們已往研究證實(shí)了心肌缺血后microRNA34a曾多,而且nicroRNA34a與ALDH2的mRNA特異性結(jié)合可降低ALDH2翻譯水平。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為解釋心肌缺血過(guò)程中ALDH2減低提供了表觀遺傳學(xué)思路,但僅憑microRNA無(wú)法完全解釋該現(xiàn)象。因此,繼續(xù)探索影響ALDH2轉(zhuǎn)錄的相關(guān)機(jī)制或是解決這一問(wèn)題的可行思路,而作為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,DNA甲基化恰可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。因此,我們提出假設(shè)：在心肌缺血過(guò)程中,缺血缺氧刺激導(dǎo)致了ALDH2啟動(dòng)子等基因調(diào)控序列的甲基化水平發(fā)生了變化,該DNA甲基化水平的變化進(jìn)一步導(dǎo)致了ALDH2轉(zhuǎn)錄水平降低。為了解釋這一問(wèn)題,我們首先開(kāi)展了有關(guān)ALDH2特異性低甲基化基因序列(LMR, low-methylated region)區(qū)域方法學(xué)研究,通過(guò)對(duì)比MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽法(BSP, Bisulfite sequencing PCR)兩者的檢測(cè)效果,為ALDH2特點(diǎn)基因序列選擇適宜的DNA甲基化檢測(cè)方法(第一部分)。在優(yōu)化DNA甲基化檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步在Sprague Dawley大鼠上完成了心肌梗死模型以及后續(xù)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)分析大鼠心梗邊緣心肌組織的ALDH2蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子相關(guān)區(qū)域序列的甲基化水平,本研究擬探討導(dǎo)致缺血心肌ALDH2表達(dá)降低的DNA甲基化機(jī)制,并尋找發(fā)生甲基化異常的基因序列,為臨床心肌梗死診療提供新的思路及靶點(diǎn)(第二部分)。目的通過(guò)比較MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP)在大鼠ALDH2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)效果,為確定適用于低甲基化基因序列檢測(cè)的最佳方式提供依據(jù)。方法取10只體重為(200+10)g之間的雄性SD大鼠,分2組,每組5只,分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組行心臟冠脈左前降支結(jié)扎術(shù),制備心肌梗死模型。常規(guī)飼養(yǎng)7天后同時(shí)取材,實(shí)驗(yàn)組取材部位為梗死邊緣區(qū)心肌組織,對(duì)照組取材位置與實(shí)驗(yàn)組相同。提取邊緣區(qū)心肌組織DNA。分別使用MassARRAY定量分析法與普通BSP法檢測(cè)兩組ALDH2基因核心啟動(dòng)子上游同一段DNA序列甲基化情況。結(jié)果BSP法可檢測(cè)顯示目標(biāo)區(qū)域12個(gè)CpG位點(diǎn),檢測(cè)結(jié)果示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組皆無(wú)DNA甲基化發(fā)生；MassARRAY定量分析法可檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域10個(gè)CpG位點(diǎn),結(jié)果提示該DNA序列在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組均有有輕度DNA甲基化,且實(shí)驗(yàn)組5號(hào)、6號(hào)及7號(hào)CpG位點(diǎn)的甲基化水平與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論對(duì)于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法擁有更好的DNA甲基化檢測(cè)精度,在定量分析DNA甲基化方面優(yōu)于BSP法。ALDH2基因啟動(dòng)子相關(guān)序列中的部分特殊序列需采用MassARRAY檢測(cè)方式。目的通過(guò)比較MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP)在大鼠ALDH2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)效果,為確定適用于低甲基化基因序列檢測(cè)的最佳方式提供依據(jù)。方法取10只體重為(200+10)g之間的雄性SD大鼠,分2組,每組5只,分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組行心臟冠脈左前降支結(jié)扎術(shù),制備心肌梗死模型。常規(guī)飼養(yǎng)7天后同時(shí)取材,實(shí)驗(yàn)組取材部位為梗死邊緣區(qū)心肌組織,對(duì)照組取材位置與實(shí)驗(yàn)組相同。提取邊緣區(qū)心肌組織DNA。分別使用MassARRAY定量分析法與普通BSP法檢測(cè)兩組ALDH2基因核心啟動(dòng)子上游同一段DNA序列甲基化情況。結(jié)果BSP法可檢測(cè)顯示目標(biāo)區(qū)域12個(gè)CpG位點(diǎn),檢測(cè)結(jié)果示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組皆無(wú)DNA甲基化發(fā)生；MassARRAY定量分析法可檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域10個(gè)CpG位點(diǎn),結(jié)果提示該DNA序列在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組均有有輕度DNA甲基化,且實(shí)驗(yàn)組5號(hào)、6號(hào)及7號(hào)CpG位點(diǎn)的甲基化水平與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論對(duì)于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法擁有更好的DNA甲基化檢測(cè)精度,在定量分析DNA甲基化方面優(yōu)于BSP法。ALDH2基因啟動(dòng)子相關(guān)序列中的部分特殊序列需采用MassARRAY檢測(cè)方式。第一部分MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)乙醛脫氫酶2低甲基化基因序列效果的對(duì)比研究目的探索缺血缺氧條件下,心肌乙醛脫氫酶2(ALDH2)啟動(dòng)子甲基化水平的變化,并從DNA甲基化這一角度解釋缺血心肌ALDH2水平降低。方法取40只體重為(200±10)g之間的雄性SD大鼠,分4組,每組10只,其中三組為心肌梗死模型組,造模方法為心臟冠脈左主干結(jié)扎術(shù),剩余一組為空白對(duì)照組。心肌梗死模型三組根據(jù)術(shù)后取材時(shí)間分為心梗一周組、心梗二周組及心梗三周組。取材部位為心肌梗死邊緣心肌組織,對(duì)照組仿心梗組位置取材。分別檢測(cè)取材心肌的ALDH2蛋白表達(dá)、DNA甲基化相關(guān)調(diào)節(jié)酶、mRNA表達(dá)、心肌DNA甲基化總體水平及ALDH2啟動(dòng)子相關(guān)序列甲基化水平。另取10只雄性SD大鼠,注射地西他濱(DAC)干預(yù)體內(nèi)DNA甲基化,每天以1mg/kg標(biāo)準(zhǔn)給藥,一周后取材及檢測(cè)方法同前。結(jié)果與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2蛋白表達(dá)降低,mRNA表達(dá)降低(P0.05),但心肌DNA甲基化總體水平無(wú)顯著差異。與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2啟動(dòng)子核心區(qū)域甲基化水平無(wú)差異,兩者均屬于未甲基化區(qū)域,該結(jié)果為BSP檢測(cè)所得。MassARRAY檢測(cè)顯示,缺血心肌ALDH2啟動(dòng)子上游494bp序列存在多個(gè)甲基化異常位點(diǎn)(CpGl, CpG2及CpG7),其甲基化水平顯著高于正常心肌組織(P0.05)。給予DAC干預(yù)后該區(qū)域甲基化異常位點(diǎn)DNA甲基化水平降低,ALDH2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)升高。結(jié)論心肌梗死造成缺血缺氧刺激導(dǎo)致ALDH2啟動(dòng)子上游序列發(fā)生DNA甲基化水平升高,該表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致缺血心肌ALDH2轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平降低。DNA甲基化是調(diào)節(jié)缺血心肌ALDH2表達(dá)的重要機(jī)表觀遺傳學(xué)機(jī)制。目的探索缺血缺氧條件下,心肌乙醛脫氫酶2(ALDH2)啟動(dòng)子甲基化水平的變化,并從DNA甲基化這一角度解釋缺血心肌ALDH2水平降低。方法取40只體重為(200±10)g之間的雄性SD大鼠,分4組,每組10只,其中三組為心肌梗死模型組,造模方法為心臟冠脈左主干結(jié)扎術(shù),剩余一組為空白對(duì)照組。心肌梗死模型三組根據(jù)術(shù)后取材時(shí)間分為心梗一周組、心梗二周組及心梗三周組。取材部位為心肌梗死邊緣心肌組織,對(duì)照組仿心梗組位置取材。分別檢測(cè)取材心肌的ALDH2蛋白表達(dá)、DNA甲基化相關(guān)調(diào)節(jié)酶、mRNA表達(dá)、心肌DNA甲基化總體水平及ALDH2啟動(dòng)子相關(guān)序列甲基化水平。另取10只雄性SD大鼠,注射地西他濱(DAC)干預(yù)體內(nèi)DNA甲基化,每天以1mg/kg標(biāo)準(zhǔn)給藥,一周后取材及檢測(cè)方法同前。結(jié)果與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2蛋白表達(dá)降低,mRNA表達(dá)降低(P0.05),但心肌DNA甲基化總體水平無(wú)顯著差異。與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2啟動(dòng)子核心區(qū)域甲基化水平無(wú)差異,兩者均屬于未甲基化區(qū)域,該結(jié)果為BSP檢測(cè)所得。MassARRAY檢測(cè)顯示,缺血心肌ALDH2啟動(dòng)子上游494bp序列存在多個(gè)甲基化異常位點(diǎn)(CpGl, CpG2及CpG7),其甲基化水平顯著高于正常心肌組織(P0.05)。給予DAC干預(yù)后該區(qū)域甲基化異常位點(diǎn)DNA甲基化水平降低,ALDH2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)升高。結(jié)論心肌梗死造成缺血缺氧刺激導(dǎo)致ALDH2啟動(dòng)子上游序列發(fā)生DNA甲基化水平升高,該表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致缺血心肌ALDH2轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平降低。DNA甲基化是調(diào)節(jié)缺血心肌ALDH2表達(dá)的重要機(jī)表觀遺傳學(xué)機(jī)制。第二部分檢測(cè)缺血大鼠心肌細(xì)胞乙醛脫氫酶2啟動(dòng)子甲基化水平變化的基礎(chǔ)研究
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1305962