本文關鍵詞：CALR基因在MDS患者中的表達及其RNAi慢病毒載體對細胞生長和凋亡的影響

  更多相關文章： 鈣網蛋白基因(CALR) RNA干擾 細胞生長 細胞凋亡 骨髓增生異常綜合征(MDS)

【摘要】：目的:研究骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中鈣網織蛋白基因(Calreticulin,CALR)的表達,并構建CALR-RNAi慢病毒載體,觀察其對人MDS細胞株SKM-1細胞生長和凋亡的影響。方法:收集重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科2010年~2014年的34例MDS患者骨髓標本和8例非MDS患者骨髓標本。按照WHO分型診斷標準和MDS國際預后積分系統(tǒng),將實驗組34例患者分為高危組和低危組,對照組取另外8例同期非MDS患者的骨髓標本。所有骨髓標本通過分離單個核細胞提取總RNA,逆轉錄制備為cDNA,使用RT-PCR技術檢測兩組骨髓標本及SKM-1細胞中CALR的相對表達水平。首先查詢GenBank中CALR(human)的堿基序列,然后使用RNAi軟件設計3條RNAi靶序列、1條陰性對照序列。合成RNAi靶序列的單鏈DNA oligo,退火配對產生雙鏈,T4 DNA連接酶連接酶切后的慢病毒載體,轉化感受態(tài)大腸桿菌,PCR篩選陽性克隆并進行測序鑒定,完成RNAi慢病毒載體的制備。共轉染293T細胞進行包裝得到3種GV-CALR-RNAi重組慢病毒載體。病毒滴度采用逐孔稀釋法進行測定。三種GV-CALR-RNAi重組慢病毒分別穩(wěn)定轉染至SKM-1細胞中,通過流式細胞術檢測轉染效率。后收集各組細胞,分別提取總rna及蛋白,通過rt-pcr檢測各組細胞calrmrna表達及westernblot技術檢測各組細胞calr蛋白質的表達以驗證干擾效果,篩選出最佳靶向序列。使用含最佳靶向序列的慢病毒載體轉染skm-1細胞,cck-8法檢測干擾calr基因的表達對skm-1細胞生長的影響,流式細胞術觀察其對細胞周期的影響,annexinv/7-aad雙染法用流式細胞術觀察對細胞凋亡的影響,westernblot檢測凋亡蛋白caspase-3的水平。結果:應用rt-pcr技術檢測34例低、高危mds標本的calr表達,絕大多數(shù)標本calr基因表達明顯降低,顯著低于正常對照組(p0.01)。同時,檢測到人mds細胞株skm-1細胞中calr表達較正常對照明顯降低(p0.01)構建的3組calr-rnai重組慢病毒轉染人mds細胞株skm-1后,倒置顯微鏡下觀察gfp熒光逐漸增強,至培養(yǎng)第5天表達最強,calr-rnai(2)、calr-rnai(3)慢病毒干擾組流式細胞術檢測轉染效率均在70%以上,而calr-rnai(1)慢病毒干擾組流式細胞術檢測轉染效率在50%以下。rt-pcr檢測轉染后第5天實驗組calr-mrna表達水平,結果顯示calr-rnai(3)慢病毒載體與陰性對照組及空白對照組相比能有效降低calrmrna表達水平[(0.40±0.11),p0.01]。westernblot檢測結果也證實,calr-rnai(3)能有效敲除calr蛋白的表達,確定為最佳靶點在SKM-1細胞中轉染CALR-RNAi(3)慢病毒及陰性對照組慢病毒,通過CCK-8法檢測SKM-1細胞的生長,發(fā)現(xiàn)CALR-RNAi(3)通過干擾CALR表達可促進SKM-1細胞生長,細胞生長第5天統(tǒng)計學差異顯著(P0.05)。流式細胞術檢測實驗組和對照組細胞周期情況,結果顯示CALR-RNAi(3)組G0/G1期細胞比例(45.25±4.45)%低于空白對照組(54.12±1.36)%和陰性對照組(54.67±1.26)%,且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019,P=0.014);而CALR-RNAi(3)組S期細胞比例細胞比例為(46.15±2.99),明顯高于空白對照組和陰性對照組[(38.42±2.11)%和(36.23±3.25)%,P0.05。AnnexinV/7-AAD雙染法用流式細胞儀檢測凋亡細胞,發(fā)現(xiàn)CALR-RNAi(3)組較陰性對照組和空白對照組細胞凋亡減少(圖7),且有顯著性差異(P0.05)。用Western blot檢測各組細胞中cleaved-caspase-3的表達。結果顯示,與陰性對照組和空白對照組相比,cleaved-caspase-3的表達在CALR-RNAi(3)組中明顯降低。結論:CALR基因在MDS中起到抑癌基因的作用,構建的GV-CALR-RNAi(3)重組慢病毒載體有利于進一步研究CALR基因在MDS中的作用機制。
【關鍵詞】：鈣網蛋白基因(CALR) RNA干擾 細胞生長 細胞凋亡 骨髓增生異常綜合征(MDS)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R551.3
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-13
• 第一部分 CALR基因在骨髓增生異常綜合征患者中的表達水平及其RNAi慢病毒載體的構建13-28
• 1 材料與方法13-20
• 2 結果20-25
• 3 討論25-26
• 4 結論26
• 5 參考文獻26-28
• 第二部分 干擾CALR基因表達對骨髓增生異常綜合征細胞系SKM-1 細胞生長和凋亡的影響28-36
• 1 材料與方法28-31
• 2 結果31-33
• 3 討論33-34
• 4 結論34
• 5 參考文獻34-36
• 全文總結36-37
• 文獻綜述：CALR基因在骨髓增生異常綜合征中的作用37-45
• 參考文獻41-45
• 致謝45-46
• 攻讀學位期間的研究成果及發(fā)表的學術論文46

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 孟凡榮;陳琛;萬海粟;周清華;;慢病毒載體及其研究進展[J];中國肺癌雜志;2014年12期

2 肖志堅;;骨髓增生異常綜合征研究進展[J];臨床血液學雜志;2013年04期

3 Shikha Snigdha;Erica D Smith;G Aleph Prieto;Carl W Cotman;;Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J];Neuroscience Bulletin;2012年01期

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本文編號：1055929