本文關鍵詞：戊型肝炎規(guī)范化實驗室診斷模式的建立

  更多相關文章： 戊型病毒性肝炎 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP) 中和抑制試驗 考評血清盤 逆轉錄熒光定量PCR 逆轉錄巢式PCR

【摘要】：目的:1.系統(tǒng)評估我國主流HEV抗原/抗體ELISA檢測試劑盒的診斷靈敏度、特異度及相互間結果符合度,形成可指導臨床實驗室應用的HEV血清學檢測試劑盒的質量報告,以規(guī)范戊型肝炎的實驗室診斷流程。2.設計出充分滿足臨床診斷靈敏度和特異度要求的能夠檢測HEV不同基因型病毒株的一步法熒光定量逆轉錄PCR(Real-time RT-PCR)檢測體系;并初步建立起HEV RNA考評血清盤和質粒標準品,用于評價HEV核酸檢測的質量評估。3.建立起不依賴特殊設備和專業(yè)人員操作的快捷高效檢測HEV RNA的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)平臺。方法:1.收集戊肝患者、健康體檢人群、風濕免疫病患者及巨細胞病毒(CMV)和EB病毒感染早期患者血清樣本,分別用萬泰、科華、貝爾、麗珠、新創(chuàng)HEV IgM和IgG抗體檢測試劑盒對上述標本進行平行檢測,以考察不同試劑盒各自的診斷靈敏度和特異度及相互間的結果符合率。2.用HEV細胞培養(yǎng)上清液作為中和抗原,通過中和抑制實驗的方法來驗證各HEV抗體檢測試劑盒間檢測結果不一致時是否為真陽性。3.在HEV ORF3高度保守區(qū)設計能檢測HEV不同基因型病毒株的PCR引物和探針引物,建立起一步法(Real time RT-PCR)檢測體系;將擬擴增的HEV RNA目的基因片段構建成質粒,以建立HEV質粒DNA標準品,用于濃度標準曲線的構建;構建HEV基因1-4型病毒株細胞培養(yǎng)體系,將培養(yǎng)上清液通過陰性血清倍比稀釋的方式初步建立評價HEV RNA檢測的考評血清盤。4.在HEV基因組保守區(qū)域內(nèi)的6個位點區(qū)域設計4條特異性引物,建立起適用于不同基因型HEV RNA檢測的一步法逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP);采集臨床患者血清標本和豬、兔糞便標本分別用RT-LAMP方法、Real time RT-PCR及逆轉錄巢式PCR(RT-nPCR)方法進行并行檢測,以驗證RT-LAMP方法的有效性;用其它病毒性肝炎病原體來驗證其特異性,通過陽性標本HEV RNA梯度倍比稀釋的方式來驗證其靈敏度。結果:1.不同廠家HEV IgM抗體檢測試劑盒檢測結果具有良好的一致性,診斷靈敏度普遍欠佳,均未超過85%,特異度很好,未在非戊肝患者人群中發(fā)現(xiàn)HEV IgM抗體陽性現(xiàn)象。2.不同廠家HEV IgG抗體檢測試劑盒在戊肝患者人群中檢測結果具有較好的一致性,診斷靈敏度較高(90%以上),在非戊肝患者人群中,檢測結果有較大差異,以萬泰和科華為例,萬泰試劑盒在非戊肝患者人群中抗體陽性率在16.5%-31.9%之間,而科華陽性率僅為1.1%-3.3%之間。3.通過中和抑制試驗未發(fā)現(xiàn)萬泰檢測試劑盒有假陽性現(xiàn)象,進一步說明了萬泰igg抗體試劑盒檢測靈敏度較高,而其它幾種試劑盒容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。4.hev抗原檢測試劑盒與igm和igg抗體檢測結果及hevrna檢測有很高的相關性,未發(fā)現(xiàn)igm和igg抗體均陰性而hev抗原陽性的病例。5.本研究建立了能夠高效擴增包含兔hev病毒株在內(nèi)的基因1-4型hev病毒株的檢測,適用于血清和糞便等標本,最低檢測限可達25copies/test,較傳統(tǒng)rt-npcr靈敏度高10倍以上;在103和106copies/μl兩個濃度水平處,該方法批內(nèi)和批間精密度分別低于2%和3%,具有很好的重復性;經(jīng)臨床標本驗證分析發(fā)現(xiàn)能夠用于戊肝患者及動物宿主的血清和糞便標本檢測,且靈敏度顯著高于rt-npcr。6.本研究構建了hev質粒標準品及hevrna考評血清盤,經(jīng)穩(wěn)定性驗證評估,能夠初步滿足臨床應用需求。7.本研究成功構建了適用于包含兔hev在內(nèi)基因1-4型hevrnart-lamp檢測方法。該方法最低檢測限度為5copies/test,顯著優(yōu)于rt-npcr技術,略優(yōu)于realtimert-pcr技術。與hav,hbv和hcv患者血清標本對無交叉反應,特異度良好。233份血清或糞便標本對該技術進行檢測效能驗證,并將該方法與realtimert-pcr和rt-npcr分別進行平行檢測。結果顯示rt-lamp和realtimert-pcr檢測陽性率顯著高于rt-npcr,而兩者間檢測符合率高達92%,未發(fā)現(xiàn)realtimert-pcr或rt-npcr檢測陽性而rt-lamp檢測陰性的標本。結論:1.不同廠家hevigm抗體檢測試劑盒之間的檢測結果差異較小,對戊肝臨床診斷的靈敏度均在80%以上,特異性較高。hevigg抗體檢測試劑盒較igm檢測試劑盒更靈敏,但診斷特異度在不同廠家之間差異較大,經(jīng)綜合比較發(fā)現(xiàn)科華igg抗體檢測試劑盒較適合于戊肝臨床診斷檢測,與igm抗體檢測試劑盒配伍使用,能很好地彌補其靈敏度不足,又能有效解決自身診斷特異度不足的問題。2.萬泰igg抗體試劑盒較其它3種廠家靈敏度最高,更加適合于流行病學調(diào)查,鑒于科華試劑盒較低的檢測靈敏度,不適合應用于流行病學調(diào)查。3.hev抗原檢測試劑盒與hevrna檢測有很好的相關性,雖然其出現(xiàn)最早,能有效縮短hev感染的檢測窗口期,但鑒于戊肝的發(fā)病特點,當患者有癥狀就醫(yī)時抗體往往已經(jīng)出現(xiàn),因此hev抗原檢測在臨床應用中的價值仍需進一步研究,本研究未發(fā)現(xiàn)其能提高hev感染診斷效率的證據(jù)。4.本研究建立了能夠高效擴增包含兔hev病毒株在內(nèi)的基因1-4型hev病毒株的hevrna一步法realtimert-pcr檢測體系,適用于血清和糞便等標本的檢測,具有檢測靈敏度、特異性高,重復性好等特點,值得進一步優(yōu)化后進行商品化嘗試。5.本研究構建了Real time RT-PCR所需的質粒標準品,該標準品易制備、易精確定量,儲存條件簡單,穩(wěn)定性好。解決了HEV RNA Real time RT-PCR檢測臨床實驗室推廣應用的瓶頸。6.本研究初步制備了HEV RNA檢測考評血清盤,對Real-time RT-PCR檢測HEV RNA的臨床推廣所面臨的標準化和結果可控可比的問題進行了初步探索。該血清盤目前針對我國HEV感染人群和動物宿主中主要基因型(基因4型)的特點而制備,未來仍需進一步完善豐富其覆蓋的基因型別。7.本研究初步建立了RT-LAMP技術檢測HEV RNA的新方法,在特異度、靈敏度和臨床標本檢測驗證中表現(xiàn)出了良好效果。該方法不需要昂貴的設備和繁瑣的電泳分析過程,能高效快速的檢測出我國HEV各型主要基因型病毒株,有望成為醫(yī)院臨床實驗室特別是HEV流行區(qū)基層醫(yī)療單位HEV核酸篩查檢測的新方法。
【關鍵詞】：戊型病毒性肝炎 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP) 中和抑制試驗 考評血清盤 逆轉錄熒光定量PCR 逆轉錄巢式PCR
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.6;R446.6
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-20
• 研究現(xiàn)狀、成果12-16
• 研究目的、方法16-20
• 一、戊肝血清學診斷試劑盒的效能評價20-34
• 1.1 對象和方法20-28
• 1.1.1 標本來源及試劑耗材和設備情況20-21
• 1.1.2 不同品牌HEV抗原/抗體ELISA試劑盒檢測效能評估21-27
• 1.1.3 中和抑制試驗考評試劑盒檢測特異性27-28
• 1.1.4 統(tǒng)計處理28
• 1.2 結果28-31
• 1.2.1 不同品牌試劑盒檢測結果分析28-30
• 1.2.2 中和抑制試驗結果分析30-31
• 1.2.3 HEV抗原檢測結果與IgM/Ig G及核酸檢測結果的相關性分析31
• 1.3 討論31-33
• 1.4 小結33-34
• 二、規(guī)范化HEV RNA熒光定量RT-PCR檢測及考評體系的建立34-60
• 2.1 對象和方法35-49
• 2.1.1 樣本來源35
• 2.1.2 試劑及溶液配制和設備說明35-37
• 2.1.3 糞便懸液及血清的制備37
• 2.1.4 HEV RNA的提取37-38
• 2.1.5 HEV RNA熒光定量RT-PCR檢測體系的建立38-44
• 2.1.6 逆轉錄巢式PCR方法檢測HEV RNA44-48
• 2.1.7 考評血清盤及質控血清品的初步構建48-49
• 2.1.8 核酸序列分析及生物進化樹分析49
• 2.2 結果49-56
• 2.2.1 標準曲線的建立49-51
• 2.2.2 靈敏度最低檢出限51-52
• 2.2.3 精密度(重復性)驗證52-53
• 2.2.4 特異度驗證53
• 2.2.5 Real time RT-PCR與RT-nPCR檢測方法的對比53-54
• 2.2.6 血清盤制備情況54-55
• 2.2.7 南京地區(qū)戊肝患者分子流行病學分析55-56
• 2.3 討論56-59
• 2.4 小結59-60
• 三、RT-LAMP檢測技術在HEV RNA檢測技術中的應用60-74
• 3.1 對象和方法60-66
• 3.1.1 標本來源60-61
• 3.1.2 試劑及設備61
• 3.1.3 RT-LAMP技術原理及操作步驟61-65
• 3.1.4 RT-LAMP技術檢測HEV RNA靈敏度及特異度分析65-66
• 3.1.5 臨床樣本驗證RT-LAMP技術檢測HEV RNA的有效性66
• 3.2 結果66-70
• 3.2.1 RT-LAMP技術檢測HEV RNA的方法的建立66-67
• 3.2.2 靈敏度及特異度分析67-69
• 3.2.3 臨床標本驗證分析69-70
• 3.3 討論70-72
• 3.4 小結72-74
• 全文結論74-75
• 論文創(chuàng)新點75-76
• 參考文獻76-81
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明81-83
• 綜述 我國戊型肝炎流行、診斷與防治的研究進展83-106
• 綜述參考文獻99-106
• 致謝106-107
• 個人簡歷107

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