本文關鍵詞：高遷移率族蛋白1促進丙型肝炎病毒復制的機制研究

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【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)病毒體呈球形,為單股正鏈RNA病毒,HCV感染可發(fā)展為慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。目前針對HCV感染尚無有效的保護性疫苗,并且針對HCV感染的治療手段仍然有限。以往的報道證實許多宿主因子可能涉及丙型肝炎的發(fā)病機理,例如：La抗原,多聚胞嘧啶結合蛋白2 (PCBP2)等。高遷移率族蛋白1(HMGB1)作為高遷移率族蛋白家族的成員之一,是一種非組蛋白核蛋白。HMGB1由兩個同源DNA結合結構域和一個高度帶負電荷的羧基端結構域組成,有報道表明HMGB1可以結合DNA,也可結合雙鏈RNA和免疫性RNA作為核酸介導的先天性免疫反應廣泛傳感器。盡管在最近報道稱由病毒感染的細胞釋放出來的HMGB1可阻止HCV感染,但細胞內的HMGB1在HCV復制和(或)翻譯中所起的作用并不知道。在本課題中,我們研究了高速遷移族蛋白1對HCV復制和翻譯的影響。我們發(fā)現(xiàn)在HCV感染的細胞中,過表達HMGB1時,HCV的RNA水平和蛋白水平隨之顯著性的升高；敲除HMGB1時,HCV的RNA水平和蛋白水平也隨之顯著性的降低。隨后,我們運用HCV雙順反子質粒系統(tǒng)(pRL-HL)和HCV IRES RNA報告系統(tǒng)探討HMGB1對HCV翻譯的影響,結果表明HMGB1不作用于HCV的翻譯過程。免疫熒光結果顯示HCV感染的肝細胞中HMGB1由胞核轉移至胞質,通過免疫沉淀和RNA結合蛋白免疫共沉淀實驗證實,HMGB1與HCV正鏈RNA結合。進一步的實驗表明：HMGB1是通過A box結構域與HCV 5'UTR的莖環(huán)結構4(SL4)相互作用,從而起到促進HCV復制的作用。這些結果表明了HMGB1是一種HCV RNA結合蛋白,且作為促病毒因子促進HCV感染。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒(HCV) 高遷移率族蛋白1 5’非翻譯區(qū)(5’UTR) 病毒復制
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-18
• 1.1 丙型肝炎病毒概述10-14
• 1.1.1 丙型肝炎病毒的發(fā)現(xiàn)及流行病學10-11
• 1.1.2 HCV的結構與功能11-13
• 1.1.3 HCV新藥物研發(fā)進展13-14
• 1.2 HMGB1蛋白的研究進展14-16
• 1.2.1 HMGB1蛋白的結構14-15
• 1.2.2 HMGB1蛋白的功能15-16
• 1.3 本課題的研究方案及目的16-18
• 第2章 HMGB1對HCV的影響18-41
• 2.1 前言18
• 2.2 實驗材料18-19
• 2.2.1 實驗耗材與試劑18-19
• 2.2.2 主要實驗儀器和設備19
• 2.3 實驗方法19-31
• 2.3.1 特異性HMGB1-shRNA的制備19-22
• 2.3.2 HMGB1過表達載體質粒的制備22-23
• 2.3.3 細胞培養(yǎng)23-24
• 2.3.4 質粒轉染及RNA轉染24-25
• 2.3.5 RNA的提取25-26
• 2.3.6 逆轉錄PCR(Reverse Transcription PCR)26-27
• 2.3.7 熒光定量PCR(SYBR Green法)27-28
• 2.3.8 蛋白質的提取28
• 2.3.9 蛋白質濃度的測定(Bio-Rad試劑盒)28
• 2.3.10 蛋白免疫印跡(Western Blot)28-31
• 2.3.11 細胞活力測定實驗(MTS)31
• 2.3.12 統(tǒng)計學分析31
• 2.4 實驗結果31-40
• 2.4.1 特異性HMGB1-shRNA沉默效果鑒定31-32
• 2.4.2 特異性p3×FLAF-CMV-HMGB1過表達效果鑒定32-33
• 2.4.3 HMGB1對HCV的影響33-35
• 2.4.4 HMGB1對HCV復制和翻譯的影響35-37
• 2.4.5 胞內外HMGB1對HCV起著不同的功能作用37-40
• 2.5 小結與討論40-41
• 第3章 HMGB1與HCV正鏈5'UTR莖環(huán)結構4相結合41-58
• 3.1 前言41
• 3.2 實驗材料41-42
• 3.2.1 實驗耗材與試劑41-42
• 3.2.2 主要實驗儀器和設備42
• 3.3 實驗方法42-49
• 3.3.1 引物設計42
• 3.3.2 免疫熒光(Immunofluorescence)實驗步驟42-44
• 3.3.3 激光共聚焦44-45
• 3.3.4 免疫共沉淀45-46
• 3.3.5 Western Blot實驗步驟46
• 3.3.6 RNA結合蛋白免疫共沉淀(RIP)46-48
• 3.3.7 細胞培養(yǎng)48
• 3.3.8 細胞轉染48
• 3.3.9 體外轉錄(Ambion試劑盒)48-49
• 3.3.10 統(tǒng)計學分析49
• 3.4 實驗結果49-56
• 3.4.1 HMGB1蛋白與HCV正鏈RNA相結合49-52
• 3.4.2 HCV 5’UTR為HMGB1的結合區(qū)域52-55
• 3.4.3 HMGB1蛋白與HCV 5’UTR莖環(huán)結構4(SL4)相互作用55-56
• 3.5 小結與討論56-58
• 第4章 HMGB1 A box是HCV 5'UTR的結合區(qū)域及關鍵功能區(qū)域58-70
• 4.1 前言58-59
• 4.2 實驗材料59
• 4.2.1 實驗耗材與試劑59
• 4.2.2 主要實驗儀器和設備59
• 4.3 實驗方法59-65
• 4.3.1 HMGB1分段過表達質粒的構建59-64
• 4.3.2 HMGB1分段過表達質粒的表達鑒定64
• 4.3.3 細胞轉染64
• 4.3.4 RNA結合蛋白免疫共沉淀(RIP)64
• 4.3.5 免疫共沉淀64
• 4.3.6 逆轉錄PCR64
• 4.3.7 熒光定量PCR(SYBR Green法)64
• 4.3.8 統(tǒng)計學分析64-65
• 4.4 實驗結果65-69
• 4.4.1 重組質粒的構建65-66
• 4.4.2 HMGB1各分段與HCV 5’UTR RNA之間的作用66-68
• 4.4.3 HMGB1蛋白各分段在促進病毒復制中的作用68-69
• 4.5 小結與討論69-70
• 結論70-73
• 參考文獻73-80
• 附錄 攻讀碩士學位期間所發(fā)表的學術論文80-81
• 致謝81-82

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本文編號：948122