本文關(guān)鍵詞：抗肝纖維化新型異喹啉類化合物的篩選及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 肝纖維化 肝星狀細(xì)胞 異喹啉化合物 細(xì)胞凋亡

【摘要】：背景與目的:活化的HSC凋亡障礙是肝纖維化難以逆轉(zhuǎn)的主要原因。異喹啉生物堿具有明顯細(xì)胞毒作用,可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。為了保留異喹啉生物堿促凋亡活性并降低其細(xì)胞毒性,與復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系合作,我們構(gòu)建了新型異喹啉類小分子化合物庫(kù)。本課題的目的是從新型異喹啉類小分子庫(kù)篩選出細(xì)胞毒性低促凋亡生物活性強(qiáng)的具有抗肝纖維化作用的新型異喹啉小分子化合物,由此希望研發(fā)出一類新型抗肝纖維化藥物先導(dǎo)化合物。方法:小分子化合物的篩查:(1)將復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系合成的小分子化合物分類整理。(2)MTT法檢測(cè)不同小分子化合物不同濃度(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml)處理HSC-T6細(xì)胞24小時(shí)后,HSC增殖改變,并計(jì)算IC50值。(3)Hochest法檢測(cè)上述篩選出的陽(yáng)性化合物(IC50100μg/ml)對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡能力的影響。12-4-Y促HSC凋亡機(jī)制的探索:(1)MTT法檢測(cè)不同濃度12-4-Y處理HSC-T6不同時(shí)間(12h、24h、36h、48h)后HSC增殖變化,臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活力;(2)Hoechst染色檢測(cè)凋亡小體;(3)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性檢測(cè);(4)檢測(cè)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3及其活化形式的表達(dá)變化;(5)Real time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化。結(jié)果:(1)MTT結(jié)果提示,所構(gòu)建的類天然小分子化合物庫(kù)中存在6種化合物(12-4-Y、12-1-Y、09-4-Y、15-1-Y、11-2-Y、09-3-Y)對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,并且呈濃度依賴性,這6種陽(yáng)性化合物的IC50值都在100μg/ml以內(nèi)。(2)Hochest染色結(jié)果顯示,上述陽(yáng)性化合物中有1種化合物處理HSC-T6后可見(jiàn)明顯的凋亡小體。這種化合物的編號(hào)為12-4-Y(1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并[5,1-a]異喹啉)。(3)進(jìn)一步以不同濃度的12-4-Y處理HSC-T6細(xì)胞株后,MTT顯示12-4-Y在12-48h及5-80μg/ml范圍內(nèi)可呈時(shí)間及濃度依賴性抑制HSC-T6增殖,臺(tái)盼藍(lán)染色顯示40μg/ml 12-4-Y處理HSC-T6細(xì)胞系12h后細(xì)胞藍(lán)染(0.53±0.04)%,與對(duì)照組(0.98±0.02)%相比明顯增多(P0.05);(4)20μg/ml 12-4-Y處理HSC-T6細(xì)胞系24h后,Hoechst染色結(jié)果提示HSC-T6細(xì)胞系內(nèi)可見(jiàn)較多的凋亡小體,同時(shí)流式細(xì)胞儀凋亡定量檢測(cè)分析提示凋亡率為(29.23±1.20)%,顯著高于對(duì)照組(5.47±1.39)%(P0.001);(5)Western blot結(jié)果提示凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3的裂解產(chǎn)物表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增加。(6)Real time PCR結(jié)果提示10μg/ml、20μg/ml 12-4-Y與HSC-T6共孵育24h后,線粒體凋亡途徑相關(guān)的促凋亡基因Bax、Caspase9的表達(dá)顯著上調(diào),抑制凋亡相關(guān)基因Bcl2表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:從異喹啉類小分子化合物庫(kù)中,我們篩選到6種新型異喹啉類小分子化合物對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6的增殖具有抑制作用;發(fā)現(xiàn)1種新型異喹啉類小分子化合物(12-4-Y)能顯著誘導(dǎo)HSC-T6凋亡,其機(jī)制可能與激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 肝星狀細(xì)胞 異喹啉化合物 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 中英文縮略語(yǔ)11-13
• 緒論13-17
• 第一部分 抗肝纖維化新型異喹啉類化合物的篩選17-27
• 引言17-18
• 1. 材料與方法18-22
• 1.1 材料18-19
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用化合物18
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑18
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)材料18
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 1.2 方法19-22
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 1.2.2 細(xì)胞處理及分組19-20
• 1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖20-21
• 1.2.4 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡21-22
• 2. 結(jié)果22-25
• 2.1 不同化合物作用HSC后細(xì)胞活力改變22-24
• 2.2 不同化合物對(duì)細(xì)胞凋亡的作用24-25
• 3. 討論25-27
• 第二部分 新型異喹啉化合物促肝星狀細(xì)胞凋亡機(jī)制研究27-49
• 引言27-29
• 1 材料與方法29-39
• 1.1 材料29-32
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)化合物29
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞29
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑29-31
• 1.1.4 試劑配制31
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)耗材及儀器31-32
• 1.2 試驗(yàn)方法32-39
• 1.2.1 大鼠活化肝星狀細(xì)胞的培養(yǎng)與MTT檢測(cè)32-33
• 1.2.2 細(xì)胞周期檢測(cè)33-34
• 1.2.3 凋亡定性（凋亡小體）檢測(cè)34
• 1.2.4 凋亡定量（流式細(xì)胞術(shù)）檢測(cè)34-35
• 1.2.5 Western blot檢測(cè)caspase3及其活化形式的表達(dá)變化35-37
• 1.2.6 Realtime PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化37-39
• 1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理39
• 2 結(jié)果39-45
• 2.1 124Y對(duì)HSC細(xì)胞系增殖的影響39-42
• 2.1.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 124Y對(duì)HSC-T6細(xì)胞系增殖抑制效果39-40
• 2.1.2 細(xì)胞周期檢測(cè) 124Y對(duì)HSC-T6是否有周期阻滯作用40-42
• 2.2 124Y促進(jìn)HSC細(xì)胞系凋亡的效果42-43
• 2.2.1 HSC凋亡的定性檢測(cè)：Hoechst檢測(cè)凋亡小體42
• 2.2.2 HSC凋亡的定量檢測(cè)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)42-43
• 2.3 124Y促進(jìn)HSC凋亡機(jī)制的初探43-45
• 2.3.1 Western blot檢測(cè)caspase3及其活化形式表達(dá)變化43-44
• 2.3.2 Real-time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化44-45
• 3 討論45-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-61
• 致謝61-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：884907