本文關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化模型鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的系統(tǒng)生物學(xué)分析及治療靶點(diǎn)探究

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【摘要】：原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種自身免疫介導(dǎo)的漸進(jìn)性膽汁淤積性肝臟疾病,涉及諸多的免疫細(xì)胞參與疾病發(fā)展進(jìn)程,但是每種細(xì)胞所發(fā)揮的特定功能卻依然不甚明確。CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在維持免疫穩(wěn)態(tài),阻止過度免疫應(yīng)答方面具有不可替代的作用,無論在人類PBC還是小鼠模型中均出現(xiàn)了明顯的Tregs缺陷。本論文的研究工作基于PBC小鼠疾病模型一一顯性失活的轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體(dnTGF-βRⅡ轉(zhuǎn)基因小鼠,尋找對(duì)三個(gè)基本問題的答案：第一、小鼠PBC模型中的Tregs的缺陷出現(xiàn)在什么范疇；第二、小鼠PBC模型中的Tregs在疾病進(jìn)程中是否依然具有對(duì)過度免疫應(yīng)答的抑制能力,即Tregs究竟扮演積極亦或消極的作用；第三、將小鼠PBC模型中的CD4+T細(xì)胞置換為正常的CD4+T細(xì)胞是否足以逆轉(zhuǎn)膽管炎癥的發(fā)生。 首先,使用高分辨率的微陣列技術(shù),配合定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)結(jié)果的嚴(yán)格確認(rèn),我們發(fā)現(xiàn)dnTGF-βRⅡ來源的Tregs同正常小鼠來源的Tregs之問存在廣泛差別。重要的轉(zhuǎn)錄因子Eos、Ahr、Klf2、Foxp1在dnTGF-βRⅡTregs中顯著下調(diào)。而且在Tregs功能方面,模型鼠Tregs表現(xiàn)出高度活化,甚至是促炎性的表型,譬如上調(diào)Ccl5、Granzyme B和IFN-γ�；蛲返姆治霭凳�,初始的TGF-p信號(hào)的缺失可能是造成免疫調(diào)節(jié)功能下調(diào)的誘因。這些發(fā)現(xiàn)細(xì)致的描繪了模型鼠Tregs存在的遺傳缺陷,并強(qiáng)調(diào)出一些需要在人類PBC研究中拓展研究的基因和信號(hào)通路。生物信息學(xué)層次提供的信息揭示了模型鼠Tregs所存在TGF-β信號(hào)依賴和非依賴的異常。 隨后,我們構(gòu)建了CD4+T細(xì)胞缺陷,同樣包含Tregs缺陷的dnTGFβRⅡ;CD4小鼠。與dnTGF-βRⅡ小鼠相比,dnTGFβRⅡ;CD4-/-小鼠出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的膽管炎癥。在CD4+T細(xì)胞缺陷的情況下,肝內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞總數(shù)以及效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。這暗示dnTGFβRⅡ的Tregs對(duì)免疫系統(tǒng)依然具有負(fù)調(diào)作用。而體外共培養(yǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明dnTGF-βRⅡ的Tregs相對(duì)于WT的Tregs依然具有抑制功能,但是能力顯著削弱。 進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn),如果使用dnTGFβRⅡ;CD4-/-和B6;CD8-/-小鼠的骨髓構(gòu)建骨髓嵌合模型,在嵌合鼠中野生型CD4+T細(xì)胞回補(bǔ)的條件下,嵌合鼠的膽管炎癥明顯減輕。我們還使用了連體共生的手段,構(gòu)建了dnTGFβRⅡ;CD4-/-小鼠與野生型小鼠的血液嵌合模型,得到了同骨髓嵌合模型相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明,在致病性的CD8+T細(xì)胞依然存在的情況下,糾正CD4+T細(xì)胞所出現(xiàn)的缺陷就足以消除疾病的主要特征,因此針對(duì)CD4+T細(xì)胞的靶向治療也許能夠有效的治療PBC疾病。
【關(guān)鍵詞】：原發(fā)性膽汁性肝硬化 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 CD4~+T細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 轉(zhuǎn)化生長因子β 小鼠疾病模型 遺傳學(xué)通路分析 骨髓嵌合 連體共生
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.22;R-332
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 符號(hào)說明9-15
• 圖序15-17
• 表序17-18
• 第一章 緒論18-58
• 1.1 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)概述18-24
• 1.2 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)小鼠模型的構(gòu)建24-36
• 1.2.1 自發(fā)型PBC動(dòng)物模型25-33
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)型PBC動(dòng)物模型33-36
• 1.3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)概述36-55
• 1.3.1 Treg研究簡史36-40
• 1.3.2 Treg起源和產(chǎn)生40-46
• 1.3.3 Treg免疫調(diào)節(jié)功能實(shí)現(xiàn)的分子基礎(chǔ)46-52
• 1.3.4 Treg的可塑性(Plasticity)和穩(wěn)定性(Stability)52-55
• 1.4 Treg和自身免疫肝臟疾病PBC的聯(lián)系55-58
• 第二章 材料與方法58-94
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料58-66
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物58
• 2.1.2 小鼠手術(shù)中使用的試劑58
• 2.1.3 小鼠組織DNA的提取和基因型鑒定中使用的試劑58-59
• 2.1.4 小鼠外周血表型檢測中使用的試劑材料59
• 2.1.5 小鼠各臟器單個(gè)核細(xì)胞分離試劑和配置59
• 2.1.6 FACS檢測中使用的試劑59-63
• 2.1.7 細(xì)胞磁分選和培養(yǎng)試劑材料63
• 2.1.8 真核細(xì)胞總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的試劑和材料63-64
• 2.1.9 病理樣品制作使用的試劑和材料64-65
• 2.1.10 構(gòu)建小鼠骨髓嵌合模型中使用的試劑65-66
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備66-68
• 2.2.1 小鼠手術(shù)器械66
• 2.2.2 小鼠各組織臟器單個(gè)核細(xì)胞分離儀器66
• 2.2.3 磁性細(xì)胞分選使用的器械66
• 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用耗材和儀器66-67
• 2.2.5 病理儀器設(shè)備67
• 2.2.6 流式細(xì)胞儀67-68
• 2.2.7 小鼠組織DNA提取及基因鑒定的設(shè)備68
• 2.2.8 其他儀器68
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法68-94
• 2.3.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育68
• 2.3.2 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法68-74
• 2.3.3 小鼠臟器組織中免疫細(xì)胞的分離74-75
• 2.3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)75
• 2.3.5 流式細(xì)胞分析,flow based analyzing75-77
• 2.3.6 流式細(xì)胞分選,flow based sorting77-79
• 2.3.7 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分選和體外共培養(yǎng)抑制實(shí)驗(yàn)79-82
• 2.3.8 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)譜分析82-83
• 2.3.9 生物信息學(xué)信號(hào)通路分析方法83-85
• 2.3.10 使用DynaBeads富集目的細(xì)胞(陰性分選)85
• 2.3.11 骨髓嵌合小鼠的構(gòu)建85-86
• 2.3.12 構(gòu)建循環(huán)系統(tǒng)嵌合的連體共生小鼠86-87
• 2.3.13 病理HE染色樣品制作87-91
• 2.3.14 病理打分標(biāo)準(zhǔn)91-92
• 2.3.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法92-94
• 第三章 結(jié)果與討論94-135
• 3.1 引言94-95
• 3.2 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg呈現(xiàn)質(zhì)量而非數(shù)量的缺陷95-96
• 3.2.1 dnTGF-βRⅡ小鼠各臟器Treg比例和數(shù)量均未降低95-96
• 3.3 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和結(jié)果驗(yàn)證96-113
• 3.3.1 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg與野生型Treg轉(zhuǎn)錄組學(xué)比對(duì)分析96-99
• 3.3.2 dnTGFβRⅡ的Treg組學(xué)分析結(jié)果的驗(yàn)證99-104
• 3.3.3 PBC模型鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組通路分析104-113
• 3.4 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg抑制功能探究113-119
• 3.4.1 CD4缺陷的dnTGFβRⅡ小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的膽管炎癥113-119
• 3.5 WT CD4~+T細(xì)胞對(duì)膽管炎治療潛力的評(píng)價(jià)119-127
• 3.5.1 dnTGFRⅡ；CD4~(-/-)與WT；CD8~(-/-)骨髓嵌合鼠的膽管炎癥減輕119-124
• 3.5.2 dnTGFβRⅡ;CD4~(-/-)與WT血液嵌合鼠顯示膽管炎減輕124-127
• 3.6 討論127-135
• 3.6.1 對(duì)dnTGF-βRⅡTreg與WT Treg生物信息學(xué)分析的討論127-129
• 3.6.2 置換CD4~+T細(xì)胞對(duì)PBC治療潛力的討論129-131
• 3.6.3 實(shí)驗(yàn)中存在的問題和缺陷131-133
• 3.6.4 基于dnTGFβRⅡ小鼠模型對(duì)PBC研究的展望133-135
• 參考文獻(xiàn)135-157
• 致謝157-159
• 第四章 攻讀博士期間的主要研究成果159-161
• 4.1 發(fā)表和擬發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況159
• 4.2 攻讀博士期間參加的學(xué)術(shù)會(huì)議和培訓(xùn)159-160
• 4.3 攻讀博士期間所獲得的獎(jiǎng)勵(lì)160-161
• 附錄161-164

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：877718