發(fā)布時間：2017-09-18 18:28

  本文關鍵詞：EPAC對乙醛誘導的大鼠肝星狀細胞增殖和激活的作用

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【摘要】：酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長期大量飲酒而導致的肝臟損害性病變。酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD進展為酒精性肝硬化或肝癌的中間階段和必經(jīng)病理過程。在ALF的發(fā)生過程中,乙醇可通過其直接代謝產(chǎn)物乙醛激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC),活化的HSC是肝纖維化過程中細胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix,ECM)的主要來源,也是各種因素所致肝纖維化發(fā)生的核心和關鍵環(huán)節(jié)。cAMP信號通路是細胞內(nèi)非常重要的信號傳遞途徑之一,最初認為蛋白激酶A(PKA)是其唯一的下游效應因子。cAMP/PKA通過磷酸化cAMP反應序列結合蛋白(CREB)的Ser-133位點使之活化,然后作用于cAMP反應序列影響基因表達,進而調(diào)控細胞的生長、分化。課題組前期研究已經(jīng)探討了cAMP/PKA/CREB信號通路在大鼠酒精性肝纖維化模型和乙醛刺激的大鼠肝星狀細胞中的作用。EPAC(exchange protein directly activated by cAMP)是一種由cAMP激活的鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs),又稱為cAMP-GEF,是1998年de Rooij等新發(fā)現(xiàn)的獨立于PKA的cAMP下游效應因子,在許多重要的細胞生理病理進程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。這提示了cAMP細胞中的效應可能不只是由以前鑒定的靶蛋白所介導。cAMP通過EPAC活化Rapl, Rapl是Ras樣的小分子G蛋白,通過與EPAC結合而被活化,EPAC能增加這類小分子G蛋白對GTP的攝取并使之形成有活性的GTP結合構象。目前為止已發(fā)現(xiàn)了兩種EPAC亞型：EPAC1 (RapGEF3)和EPAC2 (RapGEF4),由不同的基因編碼。那么,EPAC基因是否在大鼠肝星狀細胞中表達呢?如果表達又起到什么樣的作用呢?是否和PKA作用相同?因此,本課題的研究內(nèi)容是在采用乙醛誘導HSC-T6細胞建立離體大鼠酒精性肝纖維化HSC模型的基礎上,運用RNA干擾技術和EPAC激動劑,觀察EPAC1和EPAC2的表達對α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達的影響,為酒精性肝纖維化的防治提供新的靶點。主要內(nèi)容概括如下：1.EPAC在大鼠肝星狀細胞中的表達情況實驗采用大鼠HSC-T6細胞系為研究對象,用濃度為200μM乙醛處理細胞48 h,實時熒光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot分別檢測EPAC1和EPAC2的mRNA與蛋白的表達水平。結果顯示,EPAC1和EPAC2在正常HSC均有表達,與正常組比較,經(jīng)200μM乙醛作用48 h后,HSC模型組EPAC2表達水平明顯增高,而EPAC1表達水平顯著下降。提示EPAC1和EPAC2在乙醛誘導的HSC中可能起到不同的作用。2. EPAC對乙醛刺激的HSC—T6增殖和激活的作用實驗設正常對照組(常規(guī)培養(yǎng)), 模型組,EPAC激動劑(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium hydrate, Me-cAMP)組。除正常對照組外其余各組均以200μM乙醛作用48 h,制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。Me-cAMP組在乙醛作用24 h后再加入Me-cAMP繼續(xù)共同作用24 h。利用MTT法檢測Me-cAMP對細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測Me-cAMP對細胞周期的影響。qRT-PCR及Westernblot法分別檢測HSC-T6的α-SMA、Ⅰ型和III膠原mRNA和蛋白表達以及Rapl的蛋白表達。與模型組比較,Me-cAMP明顯增加了EPAC1和2的表達,使EPAC1的表達升高了約三倍,并且使細胞增殖活力明顯下降。流式細胞分析表明Me-cAMP使S期和G2/M期細胞數(shù)目比例顯著下降。qRT-PCR及Western blot實驗表明α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ膠原的表達與模型組比較,均呈現(xiàn)出顯著下降。當EPAC被激活之后,EPAC的下游分子Rap1活性形式Rap1-GTP的蛋白表達也同樣上升。以上結果提示,在HSC存在EPAC/Rap1信號通路,并且EPAC激活后,乙醛誘導的的HSC-T6的激活和增殖均受到抑制。3、EPAC siRNA在乙醛刺激的HSC—T6中的作用建立上述HSC模型,設計并合成EPAC1和EPAC2小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA),通過脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000瞬時轉染至HSC-T6細胞內(nèi),熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉染效率,同樣利用MTT法檢測EPAC siRNA對細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測其對細胞周期的影響；qRT-PCR及Western blot法分別檢測HSC-T6的a-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA及蛋白表達。將EPAC1和EPAC2 siRNA轉染至HSC-T6細胞內(nèi),與陰性對照組相比EPAC1和2表達水平明顯降低。MTT實驗結果說明單獨應用EPAC1 siRNA和同時應用EPAC1和2 siRNA均使乙醛誘導的HSC-T6細胞增殖活力增強,而單獨應用EPAC2 siRNA可使乙醛誘導的HSC-T6細胞增殖活力減弱。細胞周期結果也表明只有單獨應用EPAC2 siRNA使S期和G2/M期的細胞數(shù)目比例顯著下降。當靶向封閉EPAC1和EPAC2基因的表達時,α-SMA、I型和III膠原mRNA及蛋白表達亦明顯降低。將EPAC1 siRNA轉染至HSC-T6細胞內(nèi),α-SMA、型和III膠原mRNA及蛋白表達升高;將EPAC2 siRNA轉染至HSC-T6細胞內(nèi),α-SMA、I型和III膠原mRNA及蛋白表達降低。上述結果說明,EPAC2沉默可抑制乙醛誘導的HSC-T6活化與增殖,而EPAC1沉默進一步加強了乙醛誘導的HSC-T6活化與增殖。4、EPAC和PKA激活對乙醛刺激的HSC—T6表達I型和III膠原及α-SMA的作用不同實驗設正常對照組(常規(guī)培養(yǎng)),模型組,Me-cAMP組,PKA激動劑(N6-phenyladenosine-3,5-cyclic monophosphate, Phe-cAMP)組,除正常對照組外其余各組均以200 μM乙醛作用48 h,制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。Me-cAMP和Phe-cAMP組在乙醛作用24 h后再加入繼續(xù)共同作用24 h。qRT-PCR及Western blot法分別檢測HSC-T6的α-SMA、I型和Ⅲ膠原mRNA和蛋白表達以及Rap1的蛋白表達。與模型組相比,Me-cAMP抑制了細胞中α-SMA,I型和Ⅲ膠原的蛋白的表達；而PKA激動劑Phe-cAMP促進了α-SMA, collagen I和Ⅲ的蛋白的表達,與課題組前期研究結果一致。EPAC激動劑可使小G蛋白Rap1活性形式Rap1-GTP表達增多,而PKA激動劑Phe-cAMP卻對Rap1和GTP結合影響不大。這些數(shù)據(jù)表明,在乙醛誘導的HSC-T6中EPAC和PKA的激活對α-SMA,I型和Ⅲ膠原表達可能起到不同的作用；而EPAC可能通過Rap1發(fā)揮作用。綜上所述,在大鼠酒精肝纖維化HSC模型中,EPAC2表達較正常組升高,而EPAC1的表達降低。 使用EPAC激動劑Me-cAMP和沉默EPAC2基因的表達均可明顯抑制HSC-T6細胞的活化增殖。EPAC激動劑Me-cAMP不僅較大程度的增加了EPAC1的表達,而且增加了EPAC下游Rap1活性形式Rap 1-GDP的表達。運用EPAC激動劑Me-cAMP和PKA激動劑Phe-cAMP發(fā)現(xiàn)在乙醛誘導的HSC-T6中EPAC和PKA的激活對α-SMA,Ⅰ型和Ⅲ膠原表達可能起到不同的作用;而EPAC可能通過Rap1發(fā)揮作用。以上結果說明EPAC/Rap1信號通路激活可以抑制乙醛誘導的大鼠肝星狀細胞激活和增殖。
【關鍵詞】：乙醛 大鼠肝星狀細胞 EPAC1 EPAC2 Rap1
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 1 前言15-16
• 2 實驗材料16-22
• 3 實驗方法22-31
• 4 實驗結果31-44
• 5 討論44-48
• 6 結論48-49
• 參考文獻49-54
• 附錄54-55
• 致謝55-56
• 綜述56-67
• 參考文獻63-67

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本文編號：877161