本文關(guān)鍵詞：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體干細(xì)胞歸巢示蹤及結(jié)腸粘膜菌群與生理狀態(tài)相關(guān)性研究

  更多相關(guān)文章： 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡 炎癥性腸病 間充質(zhì)干細(xì)胞 腸道菌群

【摘要】：第一部分：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體干細(xì)胞歸巢示蹤研究研究背景與目的：間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多能干細(xì)胞,具有體內(nèi)組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞具有治療炎癥性腸病的重要潛在應(yīng)用價(jià)值。間充質(zhì)干細(xì)胞的移植后在受者體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸受到干細(xì)胞來(lái)源、移植方式、受者免疫狀體、移植次數(shù)等多方面因素的影響,具有顯著的個(gè)體差異。然而目前尚沒(méi)有一種可行的方法個(gè)體化地評(píng)估輸注到體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞向腸粘膜歸巢效率。傳統(tǒng)的影像學(xué)示蹤方法難以有效地區(qū)分死細(xì)胞殘片和存活的間充質(zhì)干細(xì)胞,同時(shí)也難以評(píng)估干細(xì)胞向腸粘膜的歸巢效率。共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡是近年來(lái)發(fā)明的一種新型內(nèi)鏡,能夠在體內(nèi)無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)地顯示組織形態(tài),放大倍率可達(dá)1000倍,并具有細(xì)胞水平的分辨率。共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡所采用的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,接波長(zhǎng)為505-585 nm,同增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的光學(xué)特性相匹配。本研究中我們提出使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡有可能在活體內(nèi)以細(xì)胞水平的分辨率無(wú)創(chuàng)地示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞向腸粘膜歸巢。研究方法：從Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)分離、鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,分別使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和活體染料羧基熒光素乙酰乙酸(CFSE)標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體外對(duì)標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞成像。進(jìn)一步將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(eGFP-MSC)通過(guò)靜脈注射或者腹腔注射途徑輸注到DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型體內(nèi),并使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡進(jìn)行活體成像。所獲得的圖像同對(duì)組織切片進(jìn)行免疫熒光、免疫組化和熒光免疫原位雜交得到的圖像進(jìn)行對(duì)比。明確向結(jié)腸粘膜歸巢的eGFP-MSC在共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下的形態(tài)特征。進(jìn)一步比較不同條件下eGFP-MSC向大鼠結(jié)腸炎癥粘膜的歸巢效率,分別以四種不同條件構(gòu)建移植模型1)大鼠-大鼠干細(xì)胞同種異體移植,2)人-大鼠干細(xì)胞異種移植,3)低氧處理大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞后同種異體移植,4)受體大鼠經(jīng)白消安免疫抑制處理后移植同種異體干細(xì)胞。四種條件下移植后均同法進(jìn)行共聚焦激光顯微內(nèi)鏡成像,示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞。編寫自動(dòng)化圖像識(shí)別程序,自動(dòng)識(shí)別圖像干細(xì)胞并計(jì)算頻率。研究結(jié)果：通過(guò)密度梯度離心法從供體大鼠骨髓中成功分離了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,所得細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下能成功分化為骨組織、脂肪組織和軟骨組織。間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞鑒定表達(dá)CD29(+), CD 44 (+), CD73 (+)和CD90(+),不表達(dá)CD34 (-), CD45 (-)和CDllb/c(-)。上述表型符合大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞定義。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠在體外清晰地看到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白或活體染料CFSE標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,體外成像同熒光顯微鏡觀察特征接近。使用FIVE1共聚焦內(nèi)鏡系統(tǒng)能夠在大鼠活體腸粘膜上無(wú)創(chuàng)性地觀察到eGFP-MSC,其特征為明亮的、圓形并帶有內(nèi)部異質(zhì)性的細(xì)胞核。免疫熒光、免疫組化和熒光免疫原位雜交均證實(shí)受體大鼠腸粘膜上存在eGFP陽(yáng)性的細(xì)胞。在大鼠-大鼠同種異體移植、人-大鼠異種移植、低氧誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和白消安免疫抑制受體大鼠四種不同條件干細(xì)胞移植模型中,活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠顯示移植后向受體大鼠腸粘膜歸巢的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量,并通過(guò)自動(dòng)圖像處理程序計(jì)數(shù)。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡定量發(fā)現(xiàn),經(jīng)低氧誘導(dǎo)后,eGFP-MSC向炎癥腸粘膜的效率有增加趨勢(shì)(低氧誘導(dǎo)組114.1 vs其他組合并34.3,t=2.14,P=0.0644)。研究結(jié)論：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種能夠在活體內(nèi)示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞移植后向腸粘膜歸巢的新型工具,具有良好的應(yīng)用前景。這種臨床可用的無(wú)創(chuàng)性的細(xì)胞水平示蹤技術(shù)能夠?yàn)榛颊邆�(gè)體化的干細(xì)胞治療提供依據(jù)。研究意義：本研究是世界上首次使用內(nèi)鏡設(shè)備對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤,而且具有細(xì)胞水平分辨率。對(duì)比先前的影像學(xué)示蹤方法,共聚焦激光顯微內(nèi)鏡不會(huì)受到死細(xì)胞碎片的影響,只有活的完整細(xì)胞能夠顯像,在消化道粘膜對(duì)干細(xì)胞示蹤具有明顯的優(yōu)越性。第二部分：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體評(píng)估結(jié)腸粘膜生理功能與粘膜菌群相關(guān)性研究研究背景與目的：人類腸道中寄居著數(shù)量龐大的微生物群體。近年來(lái),隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,人類腸道菌群的組成逐漸被人們認(rèn)識(shí)。人類腸道菌群在人類健康的維持中起了至關(guān)重要的作用,但在結(jié)直腸粘膜上,腸道菌群如何同宿主相互作用仍不清楚。有研究報(bào)道,結(jié)直腸菌群受到宿主腸道生理狀態(tài)的影響,例如腸道氧氣分壓顯著影響腸道菌群能量代謝。腸道菌群很可能同時(shí)受到多種宿主生理狀態(tài)的影響,然而先前研究中從未將腸道的多項(xiàng)生理功能同粘膜菌群同時(shí)進(jìn)行分析研究。這可能是受限于臨床可行性,同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)需要從同一受試者身上取得相應(yīng)數(shù)量的標(biāo)本,對(duì)受試者造成創(chuàng)傷。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是近年來(lái)進(jìn)入臨床應(yīng)用的一種新型內(nèi)鏡設(shè)備,可以在受試者消化道內(nèi)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性的成像,在提供實(shí)時(shí)組織圖像的同時(shí),反應(yīng)結(jié)直腸粘膜的多項(xiàng)生理功能。本課題中,我們創(chuàng)新性地提出了共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠通過(guò)顯示宿主腸粘膜的在體生理狀態(tài)來(lái)分析宿主與腸道菌群的相互作用關(guān)系。這有助于闡明宿主-腸道菌群相互作用規(guī)律。研究方法：自2013年11月至2014年4月,在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院召集受試者參與此項(xiàng)研究。符合納入條件的受試者常規(guī)進(jìn)行共聚焦激光顯微結(jié)腸鏡檢查。檢查過(guò)程中先進(jìn)行白光內(nèi)鏡篩查,對(duì)病變部位和臨近的正常對(duì)照部位使用探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢查。利用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡評(píng)估受試者結(jié)直腸粘膜上皮的生理狀態(tài),對(duì)結(jié)腸粘膜形態(tài)和生理功能的9個(gè)特征進(jìn)行評(píng)估,分別為杯狀細(xì)胞密度、隱窩擴(kuò)大、星狀隱窩、長(zhǎng)管狀隱窩、上皮滲漏熒光素、上皮變厚、隱窩內(nèi)有熒光素、熒光素漏出血管、浸潤(rùn)的細(xì)胞群。對(duì)所檢查部位的粘膜活檢,通過(guò)16s rDNA焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)腸粘膜菌群組成。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理得出每個(gè)樣本中各物種的含量,通過(guò)微生物多樣性分析、聚類分析、主坐標(biāo)分析與非冗余分析和LEfSe分析闡明腸道菌群組成及其同活檢部位、疾病狀態(tài)的關(guān)系,利用網(wǎng)絡(luò)分析分析結(jié)直腸粘膜菌群同結(jié)直腸粘膜形態(tài)和生理狀態(tài)間的相關(guān)關(guān)系。利用PICRUSt算法預(yù)測(cè)菌群的宏基因組,同法利用網(wǎng)絡(luò)分析分析腸粘膜生理狀態(tài)同菌群的宏基因組功能通路間的相關(guān)性。研究結(jié)果：本研究共篩查267名受試者,其中的39名患者進(jìn)入最終數(shù)據(jù)分析。所獲得的樣本共有結(jié)腸腺瘤病變25處,潰瘍性結(jié)腸炎病變5處,內(nèi)鏡下正常病變39處。粘膜菌群高通量測(cè)序的結(jié)果經(jīng)過(guò)降噪、去除低質(zhì)量序列和嵌合體等預(yù)處理步驟,共獲得554,070條優(yōu)質(zhì)序列。不同病變類型間腸粘膜菌群生物多樣性無(wú)明顯不同。腺瘤組的組內(nèi)距離和不同組的組間距離顯著高于正常粘膜的組內(nèi)距離(兩者均p0.05)。人類腸粘膜菌群聚集為三個(gè)主要的聚類,分別由普氏菌、擬桿菌和乳酸球菌主導(dǎo)。粘膜菌群的聚類同活檢部位和疾病狀態(tài)間并無(wú)顯著的相關(guān)性,但菌群與其棲息的粘膜生理狀態(tài)間存在密切的關(guān)系,后者可以通過(guò)共聚焦激光顯微內(nèi)鏡無(wú)創(chuàng)性地在體觀察。網(wǎng)絡(luò)分析顯示結(jié)直腸粘膜菌群可以分為兩個(gè)亞網(wǎng)絡(luò)與相對(duì)孤立的梭桿菌,亞網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部成員細(xì)菌間只存在正相關(guān)關(guān)系,不同亞網(wǎng)絡(luò)的成員細(xì)菌之間只存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。粘膜炎癥改變粘膜菌群中兩個(gè)亞網(wǎng)絡(luò)的平衡關(guān)系。梭桿菌同粘膜生理功能之間存在最密切的關(guān)系,而同其他粘膜細(xì)菌間沒(méi)有相關(guān)性。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)同粘膜宏基因組中多個(gè)組分存在相關(guān)關(guān)系,其中包括Ⅳ型分泌系統(tǒng)的VirD2成分。研究結(jié)論：本課題發(fā)現(xiàn)腸粘膜菌群同腸粘膜生理狀態(tài)之間存在密切的相關(guān)關(guān)系。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種臨床可用的檢查工具,可以在體內(nèi)用來(lái)研究腸粘膜生理狀態(tài)同腸粘膜菌群之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。研究意義：本研究是世界上首次將內(nèi)鏡設(shè)備應(yīng)用于腸道菌群研究,為宿主-菌群關(guān)系研究提供了一種全新的、臨床可行的研究方法。本研究所發(fā)現(xiàn)的粘膜菌群宏基因組同粘膜生理功能之間的相關(guān)性為后續(xù)機(jī)制研究提供了明確的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡 炎癥性腸病 間充質(zhì)干細(xì)胞 腸道菌群
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R57
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-15
• 符號(hào)說(shuō)明15-16
• 前言16-17
• 第一部分：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體干細(xì)胞歸巢示蹤研究17-38
• 研究背景17-19
• 對(duì)象與方法19-25
• 結(jié)果25-34
• 討論34-37
• 結(jié)論37-38
• 第二部分：共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體評(píng)估結(jié)腸粘膜生理功能與粘膜菌群相關(guān)性研究38-63
• 研究背景38-39
• 對(duì)象與方法39-45
• 結(jié)果45-60
• 討論60-63
• 結(jié)論63
• 研究意義63-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄72-74
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表74-75
• 外文論文一75-109
• 外文論文二109-151

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7 馬紹華;同種異體EGFP-BMSCs在小鼠缺血肌袋存活和歸巢能力的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

8 劉穎;人臍血基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血細(xì)胞歸巢植入及支持造血重建的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

9 賈曉蕾;不同劑量及頻次人骨毮間充質(zhì)干細(xì)胞在NOD小鼠體內(nèi)歸巢特性的研究[D];南京大學(xué);2015年

10 項(xiàng)飛;大鼠急性心梗后梗死周圍區(qū)功能蛋白的表達(dá)及其在間充質(zhì)干細(xì)胞心肌歸巢中的作用分析—蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：851550