本文關(guān)鍵詞：MiR-148a經(jīng)Hedgehog信號通路誘導(dǎo)肝星狀細胞自噬與凋亡的研究

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【摘要】：第一章:肝星狀細胞mi R-148a靶基因Gas1驗證目的:證據(jù)顯示Micro RNAs作為小短鏈非編碼RNAs參與肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展,本部分擬研究肝星狀細胞(HSCs)在饑餓誘導(dǎo)狀態(tài)下不同時點mi R-148a及Gas1(生長阻滯特異基因1)表達水平的差異并對mi R-148a預(yù)測的靶基因Gas1進行驗證,以探討HSCs在應(yīng)激狀態(tài)下mi R-148a生物學(xué)特性。方法:永生化HSCs系LX-2及T-6分別經(jīng)EBSS培養(yǎng)不同時間點后以q RT-PCR檢測mi R-148a及Gas1 m RNA表達水平差異;經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測mi R-148a可能靶基因Gas1 m RNA,并以雙熒光素酶試驗系統(tǒng)進行驗證;最后以mi R-148a模擬物及抑制劑通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染LX-2及T-6后經(jīng)Western blot和q RT-PCR法檢測Gas1蛋白質(zhì)及m RNA表達水平的變化,以明確mi R-148a對Gas1 m RNA的靶向調(diào)控作用。結(jié)果:Mi R-148a在HSCs系LX-2及T-6中表達水平隨EBSS培養(yǎng)時間的延長逐步升高,在培養(yǎng)4 h達到高峰,且mi R-148a表達與Gas1水平呈負相關(guān);生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)Gas1是mi R-148a靶基因之一,在轉(zhuǎn)染克隆野生型Gas1 3'-UTRs質(zhì)粒實驗組中,經(jīng)雙熒光素酶試驗系統(tǒng)檢測表明mi R-148a可與Gas1 m RNA的3'-UTRs結(jié)合,從而抑制雙熒光素酶活性;通過功能學(xué)研究顯示mi R-148a模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染后,與陰性對照相比,明顯地抑制Gas1蛋白質(zhì)及m RNA表達水平。結(jié)論:在饑餓誘導(dǎo)狀態(tài)下,LX-2及T-6中mi R-148a水平呈現(xiàn)時間依賴性升高,并靶向抑制Gas1 m RN A表達,為進一步研究HSCs在自噬誘導(dǎo)狀態(tài)下的生理特性提供新的思路,而mi R-148a可能成為肝纖維化治療的新靶點。第二章:Gas1經(jīng)Hedgehog信號通路抑制肝星狀細胞自噬目的:生長阻滯特異基因1(Gas1)是Hedgehog信號通路上游激動因子,現(xiàn)已證實Hedgehog信號通路與細胞自噬活性關(guān)系密切。本部分擬探討Gas1通過Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)HSCs自噬活性及相應(yīng)分子機制,為Gas1作為分子靶標干預(yù)肝纖維化提供新的思路。方法:分別以0、0.25μg/μl、0.5μg/μl、0.75μg/μl Gas1處理LX-2及T-6細胞48 h后,通過Immunoblotting、熒光顯微鏡、透射電鏡檢測自噬相關(guān)蛋白、GFP-LC3分布及自噬小體形成;以Hedgehog信號通路特異性激動劑及抑制劑干預(yù)后檢測Hedgehog通路中關(guān)鍵信號因子Patch1、Gli1及自噬標志蛋白(LC3-II、SQSTM1/p62)表達水平,以探討Gas1調(diào)節(jié)LX-2及T-6細胞自噬活性及其可能機制。結(jié)果:與陰性對照組相比,Gas1抑制HSCs自噬相關(guān)蛋白的表達呈濃度依賴性,并可抑制自噬小體形成,其中以0.75μg/μl抑制作用最為顯著;經(jīng)Gas1 si RNA處理后Hedgehog通路關(guān)鍵組分被抑制,但LX-2及T-6細胞的自噬活性增強;分別以Hedgehog通路興奮劑或抑制劑干預(yù)后,再以Gas1處理HSCs,LX-2及T-6細胞自噬活性明顯減弱或增強。結(jié)論:1.Gas1抑制LX-2及T-6細胞的自噬活性。2.Gas1抑制HSCs自噬活性通過促進Hedgehog信號通路傳導(dǎo)實現(xiàn)。第三章:Mi R-148a經(jīng)Gas1誘導(dǎo)肝星狀細胞自噬,抑制增殖、促進凋亡目的:Micro RNAs作為短鏈非編碼RNAs參與到多種生物學(xué)過程,已有研究證實mi R-148a在肝纖維化組織及肝癌細胞中表達降低,但其對HSCs自噬活性及生物學(xué)特性的影響目前尚不明確,本部分擬探討mi R-148a對HSCs自噬活性及增殖、凋亡的影響,以期為干預(yù)肝纖維化提供新的方向。方法:通過mi R-148a功能獲得與功能喪失實驗以Western blot、熒光顯微鏡、透射電鏡以及自噬抑制劑Bafilomycin al預(yù)處理等實驗方法檢測HSCs自噬水平改變,以驗證mi R-148a對HSCs自噬活性的調(diào)節(jié)作用;并通過MTS法、流式細胞術(shù)檢測mi R-148a對HSCs增殖及凋亡影響。結(jié)果:Mi R-148a明顯誘導(dǎo)饑餓誘導(dǎo)狀態(tài)下HSCs的自噬活性,表現(xiàn)為促進LC3B轉(zhuǎn)換及p62降解,熒光顯微鏡及透射電鏡檢測表現(xiàn)為免疫熒光蛋白聚集及促進自噬小體形成;抑制及過表達Gas1水平均可調(diào)節(jié)mi R-148a誘導(dǎo)的HSCs自噬活性;mi R-148a誘導(dǎo)饑餓狀態(tài)下HSCs自噬是通過抑制Gas1表達發(fā)揮作用;經(jīng)自噬抑制劑Bafilomycin al預(yù)處理后,mi R-148a顯著提升HSCs自噬水平,并抑制HSCs增殖、促進凋亡。結(jié)論:Mi R-148a經(jīng)Gas1可誘導(dǎo)肝星狀細胞自噬活性,同時抑制HSCs增殖及促進凋亡,從而為逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：肝星狀細胞 mi R-148a 生長阻滯特異基因1 靶基因 生長阻滯特異基因1 自噬 Hedgehog通路 微小RNA-148a 生長阻滯特異基因1 自噬 肝星狀細胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-10
• 前言10-32
• 參考文獻27-32
• 第一章 肝星狀細胞mi R-148a靶基因Gas1驗證32-62
• 引言32
• 1 實驗材料32-40
• 2 實驗方法40-48
• 3 結(jié)果48-55
• 4 討論55-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-62
• 第二章 Gas1經(jīng)Hedgehog信號通路抑制肝星狀細胞自噬活性62-82
• 引言62-63
• 1 實驗材料63-65
• 2 實驗方法65-66
• 3 結(jié)果66-73
• 4 討論73-78
• 結(jié)論78-79
• 參考文獻79-82
• 第三章 Mi R-148a誘導(dǎo)肝星狀細胞自噬，，抑制增殖及促進凋亡82-99
• 引言82
• 1 實驗材料82-84
• 2 實驗方法84-85
• 3 結(jié)果85-92
• 4 討論92-95
• 結(jié)論95-96
• 參考文獻96-99
• 全文總結(jié)與展望99-100
• 綜述100-104
• 部分中英文縮略詞表104-106
• 攻讀博士期間科研成果106-107
• 致謝107

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