肝纖維化（hepatic fibrosis,HF）是各種原因引起的慢性肝損害導(dǎo)致的病理過程,是發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的必要階段。肝纖維化作為一種可逆的瘢痕修復(fù)反應(yīng),在其形成過程中適當(dāng)?shù)母深A(yù)可阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。目前認(rèn)為,肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化增殖在肝纖維化的形成中起關(guān)鍵作用。如何調(diào)控HSC的活化增殖是抗肝纖維化重點研究方向。酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）是一類由胞外酸化所激活的陽離子通道,屬于ENa C/DEG家族,有四個編碼基因編碼的七種亞基蛋白:ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。酸敏感離子通道1a（acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a）作為ASICs家族的一員,活化時通道開放,介導(dǎo)Na+、Ca2+等離子的內(nèi)流,進一步引起機體一系列病理和生理變化。微小RNA（micro RNA,mi RNA）,是一類長約21～25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,能通過降解靶基因的m RNA或與靶基因m RNA... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

病人肝臟組織H&E染色、α-SMA和ASIC1a免疫組織化學(xué)檢測Fig1H&Estaining,α-SMAandASIC1aimmunohistochemistryofthepatient"slivertissue

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文-23-采用CCl4誘導(dǎo)C57BL/6j小鼠制造肝纖維化的動物模型，通過H&E染色和MASSON染色方法觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)方法檢測肝纖維化的標(biāo)志性基因α-SMA和目的基因ASIC1a的表達水平的變化。H&E染色和MASSON染色實驗結(jié)果如圖2所示，對照組小鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列整齊；CCl4誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟中肝小葉結(jié)構(gòu)混亂，肝細(xì)胞索排列異常，有假小葉形成，并且有明顯的膠原纖維生成，間質(zhì)內(nèi)有明顯的炎性浸潤情況。免疫組織化學(xué)實驗檢測小鼠肝臟中α-SMA的表達變化，結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟中α-SMA的表達水平顯著升高。由此提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的動物模型成功。免疫組織化學(xué)實驗檢測小鼠肝臟中ASIC1a的表達變化，結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟中ASIC1a的表達相比于對照組明顯升高，提示肝纖維化動物模型肝臟中ASIC1a表達水平明顯升高。綜上所述，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型的肝組織存在明顯的纖維化情況，模型建立成功，并且再肝纖維化小鼠模型中ASIC1a的表達顯著升高。圖2動物模型肝臟組織H&E染色、MASSON染色、α-SMA和ASIC1a免疫組織化學(xué)（n=8）Fig2H&Estaining,MASSONstaining,α-SMAandASIC1aimmunohistochemistryoftheanimal"slivertissue采用血小板衍生因子-BB（PDGF-BB，10ng/mL）誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6建立活化的HSC細(xì)胞模型，通過WesternBlot觀察α-SMA、Ⅰ型膠原和

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文-24-ASIC1a的蛋白表達水平。結(jié)果如圖3所示，PDGF刺激活化后，HSC中的α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白表達顯著上調(diào)，提示PDGF活化HSC成功；PDGF刺激活化后，HSC中ASIC1a的蛋白表達水平也顯著升高。提示PDGF刺激活化的HSC中的ASIC1a表達也是明顯升高的�？傊�，以上所述結(jié)果表明ASIC1a的表達在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展以及HSC活化的過程中均顯著升高。圖3活化的HSC細(xì)胞模型中α-SMA、Ⅰ型膠原和ASIC1a的蛋白表達水平（n=3）Fig3Proteinexpressionlevelsofα-SMA,typeIcollagenandASIC1ainactivatedHSCmodels*P<0.05vs.Controlgroup,**P<0.01vs.Controlgroup.4.2AAV介導(dǎo)的ASIC1a沉默可在體內(nèi)保護CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化采用8型重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的ASIC1a的ShRNA（rAAV8-ASIC1a-ShRNA）在小鼠體內(nèi)沉默其表達。首先，將小鼠的尾巴用酒精擦拭，以擴張尾靜脈血管方便進行重組腺相關(guān)病毒的注射。注射完一周后，采用CCl4或等體積的橄欖油進行肝纖維化的動物造模過程。造模結(jié)束后，通過對小鼠的新鮮肝臟進行冰凍切片，直接觀察重組腺相關(guān)病毒所攜帶的eGFP標(biāo)簽的綠色熒光在肝臟中的富集情況，判斷病毒的注射是否成功；通過免疫組織熒光技術(shù)觀察小鼠肝臟中ASIC1a蛋白的表達水平變化。結(jié)果如圖4A所示，在rAAV8-ASIC1a-ShRNA組和rAAV8-empty組中，重組腺相關(guān)病毒所攜帶得eGFP標(biāo)簽的綠色熒光都在肝臟中有明顯富集，提示rAAV8-ASIC1a-ShRNA注射成功，并成功地代謝到達肝臟部位中。免疫組織熒光實驗結(jié)果如圖4B所示，與對照組相比較，CCl4處理的模型組小鼠肝臟中

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Changes in skin levels of two neutotrophins （glial cell line derived neurotrohic factor and neurotrophin-3） cause alterations in cutaneous neuron responses to mechanical stimuli[J]. Jeffrey Lawson,Sabrina L.McIlwrath,H.Richard Koerber.  生理學(xué)報. 2008(05)



本文編號：3299506