【摘要】：【目的】探索原代培養(yǎng)胰腺腺泡細(xì)胞方法并鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞的性質(zhì)，為急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)體外模型的構(gòu)建創(chuàng)造條件，通過(guò)促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞和肺組織保護(hù)作用的研究，為今后EPO治療AP的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 【方法】分離提純胰腺腺泡細(xì)胞，將其置于DMEM-F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24h后電子顯微鏡下觀察胰腺腺泡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，并運(yùn)用PaA抗體鑒定培養(yǎng)細(xì)胞性質(zhì)。90只Sprague-Dawley(SD)大鼠分為假手術(shù)組(sham-operation group, SO)，SAP(Severeacute pancreatitis, SAP)組，EPO1000組，EPO3000組，EPO5000組，每組18只，分別按以下時(shí)間24h、48h、72h隨機(jī)處死6只。逆行胰膽管注射5%�；悄懰徕c(sodiumtaurocholate, STC)（0.1ml/100g)制備SAP大鼠模型。測(cè)大鼠肺、胰腺干濕比重及體重系數(shù)，人工碘比色法測(cè)血清AMS，Elisa試劑盒測(cè)IL-1、IL-6和TNF-α，分析3種炎性因子的相互關(guān)系；HE染色觀察胰腺和肺組織病理變化，免疫組化法檢測(cè)胰腺組織中EPOR的表達(dá)，Elisa法檢測(cè)EPOR表達(dá)水平。 【結(jié)果】①新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核比例較大。分離純化后腺泡細(xì)胞絕大多數(shù)呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核呈圓形，偏于一側(cè)，細(xì)胞間雜質(zhì)較少。②24h后可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)有所增加，細(xì)胞明顯聚集，2～3天換液后觀察細(xì)胞，細(xì)胞活性好，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，傳代良好。③經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活性達(dá)96%以上，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。④電鏡下，大量的酶原顆粒位于細(xì)胞頂部的胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在酶原顆粒聚集的區(qū)域可見(jiàn)高爾基復(fù)合體。⑤經(jīng)PaA抗體檢測(cè)腺泡細(xì)胞在免疫熒光鏡下呈現(xiàn)大片綠色熒光。⑥SAP組大鼠肺臟干濕比重大于SO組(P0.05)，經(jīng)EPO治療后，肺、胰腺水腫減輕；SAP組大鼠體重系數(shù)亦大于SO組和EPO組(P0.05)；⑦SAP組與EPO組血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯高于SO組，經(jīng)EPO治療24h和48h后，測(cè)血清AMS明顯降低（P0.05），SAP組和EPO組各時(shí)間點(diǎn)的血清炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均高于SO組, SAP組升高顯著，48h達(dá)到峰值，72h有所回落，經(jīng)EPO治療后各指標(biāo)均有下降，EPO療效呈時(shí)間依賴性，三者之間呈正相關(guān)性(r=0.534, p=0.02; r=0.584, p=0.04; r=0.820，p=0.00)，有相互促進(jìn)表達(dá)作用。⑧SO組胰腺和肺組織均無(wú)明顯病理變化；SAP組大鼠胰腺和肺組織出現(xiàn)不同程度水腫、滲出、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分組織出現(xiàn)出血、壞死、空泡形成，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)模糊，甚至連接成片；EPO治療組胰腺和肺組織病理?yè)p傷程度明顯改善，病理評(píng)分顯著低于SAP組（P0.05）。組間比較顯示：除EPO3000和EPO5000間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑨EPO治療組、假手術(shù)組大鼠胰腺和肺組織中，可見(jiàn)散在的EPOR陽(yáng)性表達(dá)，染色位置位于胞漿；不同劑量EPO治療組中EPOR在胰腺和肺組織中均呈現(xiàn)大片深染的陽(yáng)性表達(dá)。⑩ELISA法測(cè)EPOR表達(dá)量示：假手術(shù)組、SAP組EPO1000組中EPOR表達(dá)量的變化不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EPOR表達(dá)量隨EPO劑量的增加而增加。 【結(jié)論】①本實(shí)驗(yàn)方法可成功原代培養(yǎng)胰腺腺泡細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞純度及存活率高，符合體外實(shí)驗(yàn)要求；②PaA抗體可成為鑒定胰腺腺泡細(xì)胞的一種便捷、可行的方法，其特異性高，可推廣應(yīng)用于鑒定胰腺腺泡細(xì)胞；③SAP組大鼠血清中炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF-α水平呈逐漸升高趨勢(shì)；EPO可有效減輕胰腺和肺組織病理?yè)p傷，降低SAP大鼠血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平；④ELISA法及免疫組化法檢測(cè)出胰腺腺泡細(xì)胞上EPOR的表達(dá)，其表達(dá)量隨EPO劑量的增加而增加，但與治療時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性，由此推測(cè)EPO可與EPOR結(jié)合后，激活下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而起到抗炎的作用。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R576
【圖文】：

填滿標(biāo)本表面，暗室內(nèi)放置 30min，PB分，光學(xué)樹(shù)脂封片后于免疫熒光鏡下觀大鼠胰腺腺泡細(xì)胞微鏡下，新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞不規(guī)則形間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞碎片單個(gè)胰腺，直徑約為紅細(xì)胞的 4～6 倍，細(xì)胞質(zhì)

圖 1 新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞Fig.1 Freshly isolated acinar cells (o.m分離液分離純化后的胰腺腺泡細(xì)胞細(xì)胞分離液分離純化細(xì)胞后可見(jiàn)絕大多質(zhì)與細(xì)胞核比例較大，核圓形，偏于一

圖 3 培養(yǎng) 12h 后的胰腺腺泡細(xì)胞Fig.3 after 12 h culture (o.m 40×)后的胰腺腺泡細(xì)胞數(shù)有所增加，細(xì)胞聚集明顯，可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞胞活性好，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，傳代良好
【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 劉學(xué)進(jìn);陳墾;龍友明;王暉;謝文瑞;;不同濃度的脂多糖刺激AR42J細(xì)胞對(duì)NF-κB及ICAM-1表達(dá)的影響[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2007年01期

2 黃莛庭;;急性胰腺炎細(xì)胞內(nèi)早期事件的再認(rèn)識(shí)[J];中華肝膽外科雜志;2006年02期

本文編號(hào)：2851106