【摘要】：研究背景和目的：肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)是指在慢性肝病和／或門脈高壓基礎上出現(xiàn)的肺內(nèi)血管異常擴張,氣體交換障礙,動脈血氧合作用異常導致的低氧血癥及一系列病理生理變化與臨床表現(xiàn),通常包括肝硬化、動脈低氧血癥和肺內(nèi)血管擴張三聯(lián)癥。肺內(nèi)毛細血管彌漫性擴張是肝肺綜合征的基本病理改變,它的發(fā)生與擴血管物質一氧化氮(nitric oxide, NO)過度增加密切相關。 局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK), FAK含有6個可被磷酸化的酪氨酸位點,即Tyr397、407、576、577、861和925,其中Tyr397是主要的自我磷酸化位點。外部因素(如整合素、生長因子、腫瘤壞死因子等)刺激誘導FAK在Tyr397位點自身磷酸化,由此為Src的SH2結構域創(chuàng)建一個高親和力的結合位點,形成FAK/Src信號復合物并激活,FAK激活后可通過一系列信號通路如FAK-Ras-MAPK、FAK-PI3K等信號通路引起各種生物學效應。 10號染色體同源丟失性磷酸酶與張力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)基因是一具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因,它不僅有脂質磷酸酶活性,而且有蛋白磷酸酶活性。PTEN基因位于染色體10q23,其表達產(chǎn)物PTEN蛋白具有抑制細胞周期進展、誘導細胞凋亡以及抑制細胞遷移、鋪展和局部黏附等生理功能。PTEN激活后通過其磷酸酶活性使P13K的脂類產(chǎn)物PIP3的D3位脫磷酸,進而使PI3K功能喪失,從而阻斷PI3K/AKT信號通路。而PTEN表達的缺失或低表達則促進PI3K的過表達,進而引起PI3K活性的釋放并激活Akt進而引起各種生物學效應。 大量的實驗證實腸細菌移位、腸內(nèi)毒素血癥、肺單核細胞或巨噬細胞系統(tǒng)的激活在HPS的發(fā)病原理中也許發(fā)揮重要作用。肝臟內(nèi)毒素清除的機能失調(diào),并且由于存在門體靜脈分流,最終導致腸源性內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素誘導和激活體內(nèi)單核／巨噬細胞系統(tǒng),包括肝臟Kupffer細胞,脾臟巨噬細胞,肺血管巨噬細胞(PIMs)和血單核細胞。由于肝臟解毒減少,肺代償性清除細菌和毒素。隨后,血液單核細胞在肺血管內(nèi)皮積累,然后分化為肺血管巨噬細胞(PIMs).PIMs吞噬作用的功能是增加血中細菌和毒素的清除。清除血液的體內(nèi)異物之后,肺血管巨噬細胞(PIMs)被激活并分泌各種活化物質如NO, TNF-a, CO, IL-1, IL-6, IL-8和其他炎性介質。其中,TNF-α是具有代表性的炎性介質,它能誘導局部釋放單核細胞趨化因子,并可以刺激內(nèi)皮細胞和巨噬細胞表達粘附因子,進一步加劇了肺血管內(nèi)巨噬細胞大量聚集與粘附。TNF-a能激活FAK及使PTEN表達減少,激活的FAK和表達減少的PTEN通過PI3K/Akt信號通路進一步作用于NF-κB,而NF-κB參與了包括iNOS和‘TNF-α在內(nèi)的眾多炎癥因子的轉錄。這樣導致了：一方面,巨噬細胞內(nèi)iNOS過度表達,導致了NO過度生成；而另一方面,新生成的TNF-a又能進一步加強NF-κB的作用,從而形成級聯(lián)正反饋,最終使NO過度生成,導致HPS的發(fā)生。 HPS在肝硬化患者中的發(fā)生率約為15%-30%,其增加肝硬化患者的死亡率,預后極差。目前由于HPS的發(fā)病機理仍然不明,因此藥物治療的效果并不滿意。肝移植是目前唯一能夠有效的治療與逆轉HPS的方法。所以,研究肝肺綜合征的發(fā)病機理,尋求有效的治療方法至關重要。 我們前期應用膽總管結扎(common bile duct ligation, CBDL)致大鼠肝肺綜合征模型的實驗結果說明手術模型組大鼠血漿TNF-a水平、動脈血氣P(A-a)O2、NO水平較假手術組均明顯升高,而應用TNF-a McAb治療的大鼠的TNF-a等水平較同周的手術模型組均明顯降低(有統(tǒng)計學意義),并發(fā)現(xiàn)應用TNF-a McAb治療的大鼠的肝臟在組織學和生化指標上都有明顯改善。我們的前期實驗還證實了TNF-a是通過PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)其對下游因子的作用參與了HPS形成。FAK與PTEN是PI3K信號通路上游的因子,TNF-a可以激活FAK和可以使PTEN表達減少,因此,我們考慮TNF-a激活FAK、使PTEN表達減少,活化的FAK與表達減少的PTEN隨之引起PI3K信號通路的改變可能參與了HPS形成。為此,我們采用TNF-a McAb治療CBDL所致的HPS大鼠,觀察TNF-a McAb干預治療后對FAK、p-FAK. PTEN表達的影響。 方法：應用CBDL致大鼠肝肺綜合征的模型。把60只雄性Sprague Dawley大鼠隨機地分為假手術組(sham組)、CBDL組(分為CBDL1周、2周、3周、4周、5周組五個亞組)及CBDL+TNF-αMcAb干預組(CBDL+TNF-αMcAb,分為膽總管結扎1周后TNF-αMcAb干預治療1周、2周、3周、4周組四個亞組),共10個亞組,每組各6只大鼠。干預治療組于術后1周開始給與腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(TNF-αMcAb(0.1g/kg/2d),而CBDL組大鼠對應的注射相當劑量的生理鹽水,各組動物均在規(guī)定時間點取材(sham組與CBDL組第五周大鼠同時取材),應用免疫組織化學法(SP法)檢測FAK和p-FAK在肺組織中的表達定位與表達程度；采用Western blot方法檢測FAK、p-FAK和PTEN在肺組織中的蛋白表達。 結果： 1免疫組織化學法檢測肺組織FAK和p-FAK的表達 1.1肺組織FAK表達①CBDL組：大鼠肺組織內(nèi)FAK蛋白的陽性表達較多,可見細胞胞漿呈棕褐色細顆粒,陽性表達多集中在肺內(nèi)巨噬細胞胞漿中,于三周時達高峰(0.095±0.011),此后,CBDL組在四周時下降,五周時又見回升,表達均高于sham組(0.040±±0.005),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05).②TNF-αMcAb組：干預治療一周(0.058±0.003)后,與CBDL相比,FAK蛋白表達即被明顯抑制(P0.05),此后,在各時間點FAK的陽性表達均比同時間點的CBDL組弱,基本維持在上述的水平,但是仍明顯高于sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 1.2肺組織p-FAK表達p-FAK蛋白的陽性反應為黃色顆粒,主要定位在肺巨噬細胞的胞漿。①CBDL組p-FAK蛋白陽性表達在術后三周達峰值(0.087±0.004),四周時下降,五周時又有所回升,與sham組(0.034±0.002)相比,陽性細胞數(shù)目和表達強度均較高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。②TNF-αMcAb干預治療組：各時間點的p-FAK蛋白的陽性表達較CBDL組均有明顯的減少,至治療的第四周(0.035±±0.005)明顯低于同周CBDL組(0.084±0.009),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),干預治療組4周時p-FAK蛋白的陽性表達雖高于sham組,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2 Western Blot方法檢測肺組織FAK、p-FAK和PTEN的表達 2.1 Western Blot分析FAK①CBDL組FAK蛋白表達呈逐漸上升的趨勢,于術后第三周達一個高峰值(1.01±0.10),此后呈下降趨勢,均高于sham(0.27±0.02),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。②TNF-αMcAb組治療1周(0.44±0.04)后與同時間的CBDL組相比較,即被明顯的抑制,后三周干預治療組亦低于CBDL組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),干預治療組均高于sham組,差異亦有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.2 Western Blot分析p-FAK:(DCBDL組p-FAK蛋白表達于術后第三周達一個高峰值(0.55±0.05),此后呈下降趨勢,均高于sham組(0.10±0.01),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);②TNF-αMcAb組治療1周(0.18±±0.01)后與同時間的CBDL組相比較,即被抑制。后三周干預治療組均明顯低于CBDL組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),干預治療組均高于sham組,差異亦有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.3 Western Blot分析p-FAK/FAK:p-FAK/FAK在CBDL組呈逐漸上升的趨勢,至第四周時達到高峰(0.72±±0.05),與sham組比較有明顯差異(P0.05).TNF-αMcAb干預治療組與CBDL組的p-FAK/FAK整體變化趨勢基本一致,各個時間點整體均較同周CBDL組的值低,且有明顯的差異(P0.05),而第一周(0.40±±0.04)、第四周(0.42±±0.03)與sham組(0.38±±0.06)比較無明顯差異(P0.05)。 2.4 Western Blot分析PTEN:①CBDL組PTEN蛋白表達呈下降的趨勢,于術后第2周最低(0.52±±0.03),3周時升高,此后又有所下降,均低于sham組(1.01±±0.02),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05).②TNF-αMcAb組治療1周(0.62±±0.02)后與同時間的CBDL組相比較,即明顯的升高,后三周干預治療組亦高于CBDL組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),干預治療組與sham組比較,差異亦有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論： 1 HPS的發(fā)生過程中伴隨著PTEN表達的明顯降低,存在PTEN信號轉導通路的改變,說明PTEN信號轉導通路參與了HPS發(fā)生 2 HPS的發(fā)生過程中伴隨著FAK表達的明顯增加,p-FAK水平增多,存在FAK信號轉導通路的活化,說明FAK信號轉導通路參與了HPS發(fā)生 3 TNF-a McAb對HPS的治療可能是通過FAK、PTEN等信號分子發(fā)揮作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575;R563

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