【摘要】：研究背景及目的:酒精性慢性胰腺炎(ACP)的發(fā)病率逐年升高。乙醇可激活PSC被認為是ACP形成的獨立危險因素,然而5-10%的長期嗜酒者發(fā)生胰腺纖維化。內毒素脂多糖(LPS)是ACP發(fā)生的重要觸發(fā)因素之一,體內、外研究證明LPS可引起PSC激活和合成Col1增加。TGF-β1是重要的致纖維化因子,通過PSC自分泌和旁分泌調節(jié)自身激活過程,增加α-SMA和Col1表達。近年來的研究發(fā)現(xiàn)IL-6在許多疾病纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IL-6通過其受體(IL-6R)激活JAK2/STAT3信號通路可促進肝臟、肺、腎臟等多器官纖維化,但是IL-6及JAK2/STAT3通路在ACP胰腺纖維化的作用和機制尚不十分明確。本研究旨在通過人和大鼠整體水平與巨噬細胞(Mφ)和胰腺星狀細胞(PSC)細胞水平研究IL-6/JAK2/STAT3通路在ACP胰腺纖維化發(fā)生學的作用與機制。材料和方法:將33只120±20 g雄性SD大鼠隨機分為3組:(1)對照飼料喂養(yǎng)組,(2)Lieber-DeCarli酒精飼料喂養(yǎng)組,(3)對照飼料喂養(yǎng)+LPS反復注射組。LPS組于8,9,10周末每周經(jīng)尾靜脈注射LPS(3mg/kg)1次,其它兩組尾靜脈注射生理鹽水1 ml。10周末接受LPS或生理鹽水24 h后3組大鼠被異氟烷麻醉,留取胰腺組織塊。其中部分組織塊放入10%中性福爾馬林液固定,用于制備石蠟切片,部分組織塊放入液氮中保存。采用本研究室經(jīng)RSV啟動子/增強子驅動SV T抗原建立的永生化人胰腺星狀細胞系(HP-1細胞)進行體外研究。采用淋巴細胞分離液分離人末梢血單核細胞,經(jīng)粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導培養(yǎng)6天獲得巨噬細胞(Mφ)用于ALC和LPS體外造模。采用免疫組織化學檢測人胰腺組織IL-6表達,免疫雙染用于識別PSC表達IL-6R,免疫細胞化學法分別檢測Mφs和HP-1細胞IL-6和IL-6R表達。ELISA法檢測大鼠胰腺組織、人血清Mφs和HP-1細胞IL-6、TGF-β1、α-SMA和Col1α1產(chǎn)生。采用RT-qPCR檢測HP-1細胞IL-6、TGF-β1、α-SMA和Col1α1 mR NA轉錄水平。Western blot法檢測HP-1細胞p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3的含量。結果:在人ACP胰腺免疫組織學研究發(fā)現(xiàn):ACP患者與健康對照者相比胰腺組織IL-6及其受體表達上調,IL-6+Mφs和IL-6+PSCs與IL-6R+Mφs和IL-6R+PSCs數(shù)量均明顯增加(各組P0.001)。進一步研究發(fā)現(xiàn):不伴有或伴有內毒素血癥ACP患者血清IL-6,TGF-β1和Col1α1水平明顯升高(各組P0.001),升高的IL-6與TGF-β1或Col1α1水平呈正相關(r=0.6609,P0.05;r=0.6293,P0.05;r=0.6422,P0.01;r=0.5006,P0.05)。在乙醇或LPS制備的大鼠胰腺炎模型研究發(fā)現(xiàn):乙醇和LPS還可使大鼠胰腺組織IL-6,TGF-β1和Col1α1合成增加(各組P0.001),增加的IL-6與TGF-β1或Col1a1含量呈正相關(r=0.7369,P0.01;r=0.6445,P0.05;r=0.7380,P0.01;r=0.6344,P0.05)。體外研究發(fā)現(xiàn):乙醇或LPS均可誘導人Mφs和HP-1細胞IL-6R表達上調與IL-6和TGF-β1分泌增加(各組P0.001)。外源性IL-6可誘導HP-1細胞分泌TGF-β1,而TGF-β1也可誘導HP-1細胞分泌IL-6。IL-6中和抗體可部分抑制乙醇或LPS誘導HP-1細胞α-SMA和Col1α1 mR NA轉錄和蛋白合成(各組P0.001),提示IL-6是ALC和LPS誘導HP-1細胞合成α-SMA和Col1α1的一種途徑。進一步研究發(fā)現(xiàn)IL-6經(jīng)IL-6R/JAK2/STAT3通路誘導TGF-β1合成。TGF-β1ab可明顯抑制IL-6誘導HP-1細胞產(chǎn)生α-SMA和Col1α1,推測TGF-β1是IL-6誘導HP-1細胞合成α-SMA和Col1a1的中間介導者。IL-6能誘導HP-1細胞延遲出現(xiàn)Smad2/3磷酸化,而小干擾RNA si-Smad2能有效抑制IL-6誘導的α-SMA mR NA表達,si-Smad3能有效抑制IL-6誘導的Col1α1 mR NA表達(兩者P0.001)。結論:IL-6是ACP胰腺纖維化形成的重要因素之一。IL-6經(jīng)IL-6R/JAK2/STAT3通路誘導TGF-β1合成,通過上調TGF-β1/Smads通路促進PSC激活和Col1合成,本研究提示IL-6可能作為防治乙醇相關胰腺纖維化的一個靶點。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R576
【圖文】：

圖 1.1 IL-6 受體結合分類自 Mihara M et al, Clinical Science. 2012,122(4):143 159..2 IL-6 信號通路L-6 與 IL-6R 結合形成 IL-6/IL-6R 復合物誘導 gp130 二聚體形活細胞內兩種信號通路[67]：gp130 YXXQ（X 是任何氨基酸 JAK/STAT 信號途徑和 gp130 Tyr759位點介導的 Ras/Raf/ER分別發(fā)揮相應的生物學作用。1）IL-6 經(jīng) gp130 YXXQ 位點的 JAK/STAT 信號途徑：

2.3.1 ACP 胰腺組織 IL-6 及其受體表達人胰腺組織石蠟切片免疫組化結果顯示：正常胰腺組織僅有少量腺泡細胞表達 IL-6，ACP 患者胰腺組織腺泡細胞、Mφs、PSCs 和中性粒細胞均易見 IL-6 表達（Fig 2.1A，B）；免疫組化雙染結果顯示：正常胰腺組織僅有少量腺泡細胞弱表達 IL-6R，ACP 患者胰腺組織有較多的腺泡細胞和一些 Mφs、PSCs 高表達 IL-6R（Fig 2.1C，D）；對每個染色標本隨機拍照10 個高倍視野，經(jīng)計數(shù)和統(tǒng)計學處理顯示：ACP 患者胰腺組織表達IL-6或IL-6R的Mφs和PSCs數(shù)量顯著增加（各組均P<0.001）（Fig2.1E，F(xiàn)，G，H）。2.3 結 果

第 2 章 IL-6 在酒精性慢性胰腺炎胰腺星狀細胞介導纖維化的作用和機制研究2.3.2 ACP 患者血清 IL-6，TGF-β1 和 Col1α1 水平增加ELISA 結果顯示：ACP 患者血清 IL-6、TGF-β1 和 Col1α1 水平較正常對照組明顯升高，伴有內毒素血癥的 ACP 患者上述三種指標又高于不伴有內毒素血癥 ACP 的水平（各組間均 P<0.001）（Fig 2.2A，B，C）；相關性分析結果顯示不伴有或伴有內毒素血癥 ACP 患者血清 IL-6 水平與血清TGF-β1 或 Col1α1 水平均呈正相關（r=0.6609，P<0.05；r=0.6293，P<0.05；r=0.6422，P<0.01；r=0.5006，P<0.05）（Fig 2.2D，E，F(xiàn)，G）。

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本文編號：2770023