發(fā)布時間：2020-07-18 23:46

【摘要】：背景與目的:膽汁淤積即膽汁生成或排泌發(fā)生障礙,膽汁酸在肝內積聚使肝細胞暴露于持續(xù)升高的膽汁酸中,最終導致肝損傷、細胞凋亡以及細胞壞死。肝細胞損傷引發(fā)肝鄰近細胞(枯否細胞的激活、肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSCs)以及其他炎性細胞)的招募和活化,持久反復的肝星狀細胞的激活引起以廣泛瘢痕形成以及肝結構和功能紊亂為特征的肝纖維化、肝硬化。一項統計學分析顯示,2010年全球由于肝硬化引起死亡的人數已經超過1百萬。因此,肝硬化是全球健康醫(yī)療系統的一個極大負擔,絕大多數的肝硬化只能被控制,并不能被治愈。因此,找到新的危險因素以及可能的治療靶點對于防治肝硬化以及藥物開發(fā)具有重要意義。膽汁淤積是終末期肝硬化普遍的病理生理狀態(tài),以往研究表明膽汁酸與肝硬化的進展有關。我們團隊也發(fā)現某些特定膽汁酸的組成在肝硬化患者中發(fā)生改變。本課題組前期通過超高相液相色譜質譜連用儀(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)檢測了32名肝硬化患者以及27名健康志愿者的12種血清膽汁酸的濃度,結果顯示�；悄懰�(Taurocholic acid,TCA)、甘氨膽酸(Glycocholic acid,GCA)、�；敲撗跄懰�(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)發(fā)生顯著改變,這三種差異膽汁酸在肝硬化患者血清中明顯增加,其中TCA升高最顯著。此外,肝硬化患者血清TCA水平與肝硬化嚴重程度評價指標------Child-Pugh正相關。然而這些特定膽汁酸在促進肝硬化的機制并不清楚,因此,本研究通過細胞及分子學研究模擬肝硬化狀態(tài)下的體內微環(huán)境,旨在探究TCA對肝細胞、肝星狀細胞的影響及其可能機制。材料與方法:肝星狀細胞系LX-2以及肝細胞系HepG2的細胞實驗用來探究�；悄懰釋Ω渭毎�、肝星狀細胞的影響及其可能機制。分別對LX-2細胞、HepG2細胞以及Tranwell共培養(yǎng)的兩種細胞給予病理濃度的TCA干預,細胞毒性及增殖實驗、Western blot實驗以及ELISA實驗用來檢測TCA對肝細胞毒性作用、炎癥相關指標血紅素氧合酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的表達、肝星狀細胞增殖指標α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、一型膠原(type I collagen,CoI1A1)、轉化生長因子-β1(Transformed growth factorβ,TGFβ1)以及TLR4、HO-1水平。結果1.相比對照組,病理濃度下的TCA并沒有對HepG2細胞產生毒性作用,而TCA促進LX-2細胞增殖。2.相比對照組,50μM、100μM TCA干預HepG2細胞后,TLR4的表達顯著增加,HepG2細胞的HO-1表達水平也被TCA顯著誘導。3.LX-2細胞被TCA干預后,CoI1A1、α-SMA、HO-1以及TLR4的表達水平較對照組顯著增加。這些結果預示TCA促進肝星狀細胞增殖可能通過上調TLR4/HO-1信號通路。4.TCA對LX-2細胞的以上促增殖作用通過與HepG2細胞共培養(yǎng)后增強。共培養(yǎng)組LX-2細胞上清TGFβ1水平較LX-2細胞單獨培養(yǎng)組顯著增加。結論:TCA可能通過上調TLR4/HO-1信號通路誘導肝細胞以及肝星狀細胞炎癥反應,并促進肝星狀細胞增殖,進而加劇肝硬化的進展。TCA不僅僅是肝硬化進展的活性促進因子,TCA可能成為膽汁淤積性肝病預防和治療的潛在靶點。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2
【圖文】：

圖 1 Tanswell 共培養(yǎng)模式圖印跡（Western blot）方法檢測 HepG2 細胞以及 LX-2 細胞中目蛋白提取IPA 裂解液，對 HepG2 細胞以及 LX-2 細胞進行裂解，裂解液融化，在使用前數分鐘內加入 PMSF（為了避免細胞蛋白降解度為 1mM；板內的培養(yǎng)基，預冷 PBS 洗兩遍。每孔加入 RIPA 裂解液 10吹打數下，邊吹打邊輕輕晃動，使裂解液與細胞充分接觸，；充分裂解后，12000g 離心 30min，取上清。部分進行 BCA 蛋0℃冰箱凍存。

圖 2 （A）CCK8 毒性實驗檢測 HepG2 細胞的存活率（B）CCK8 增殖實驗檢測 LX-2 細胞的增殖率（*P<0.05）2. TCA 對肝細胞 TLR4 以及 HO-1 表達的影響基于以上的結果，我們選取 50μM 以及 100μM TCA 作為接下來的實驗濃度。我們可以從圖 3 看出，相比對照組，HepG2 細胞 TLR4 的表達顯著增加(P<0.05)。而且，HepG2 細胞的 HO-1 表達水平也被 TCA 顯著誘導(P<0.05)。

圖 4 TCA 對 LX-2 細胞 CoI1A1、α-SMA、HO-1 以及 TLR4 表達的影響：*P<0.05。4. TCA 加劇了與 HepG2 細胞共培養(yǎng)的 LX-2 細胞的增殖通過以上實驗，我們得出 TCA 能上調 HepG2 細胞促炎性基因 TLR4 以及 HO-表達。而且，TCA 能促進 LX-2 細胞的增殖。因此，我們對這兩種細胞進行共培養(yǎng)探討兩種細胞的交互作用。如圖 5 所示，我們的結果顯示當 LX-2 細胞與 HepG細胞共培養(yǎng)后，TCA 促進 LX-2 細胞的增殖效應更為顯著。相比 LX-2 細胞單獨用50μM TCA 處理組,50μM TCA 共培養(yǎng)組 LX-2 細胞的 CoI1A1 蛋白表達顯著增加，具有統計學意義（P<0.05）。同時，100μM TCA 單獨培養(yǎng)組與 100μM TCA 共培養(yǎng)組的 LX-2 細胞相比，后者的 CoI1A1 蛋白上調明顯（P<0.05）。我們又檢測了LX-2 細胞單獨培養(yǎng)組與共培養(yǎng)組 LX-2 細胞的 HO-1、TLR4 的蛋白表達水平，我們的數據顯示共培養(yǎng)組的 LX-2 細胞的 HO-1 以及 TLR4 的表達水平被明顯誘導，差異具有統計學意義（P<0.05）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 Qiu-Ming Wang;Jian-Ling Du;Zhi-Jun Duan;Shi-Bin Guo;Xiao-Yu Sun;Zhen Liu;;Inhibiting heme oxygenase-1 attenuates rat liver fibrosis by removing iron accumulation[J];World Journal of Gastroenterology;2013年19期

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3 Matthias Froh;Lars Conzelmann;Peter Walbrun;Susanne Netter;Reiner Wiest;Michael D Wheeler;Mark Lehnert;Takehiko Uesugi;Jurgen Scholmerich;Ronald G Thurman;;Heme oxygenase-1 overexpression increases liver injury after bile duct ligation in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2007年25期

本文編號：2761586