發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 11:06

【摘要】：研究目的 以油酸誘導(dǎo)正常人肝臟細(xì)胞L-02細(xì)胞建立NAFLD細(xì)胞模型，研究NAFLD形成前后核轉(zhuǎn)錄共激活因子PGC-1α表達(dá)、脂質(zhì)及氧化應(yīng)激水平的變化，在模型建立成功的基礎(chǔ)上添加胰島素增敏劑二甲雙胍，觀察不同濃度二甲雙胍對(duì)NAFLD細(xì)胞模型PGC-1α基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)、氧化應(yīng)激水平的影響，以及PGC-1α的表達(dá)與肝臟細(xì)胞脂肪堆積、線粒體損傷及氧化應(yīng)激的關(guān)系，探討PGC-1α在NAFLD發(fā)病過(guò)程中的作用，從而進(jìn)一步闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制及二甲雙胍用于NAFLD治療的作用機(jī)制。 研究方法 用20μg/ml油酸(油酸以0.5%DMSO溶解)誘導(dǎo)正常人肝臟細(xì)胞L-02細(xì)胞72h，建立非酒精性脂肪變性肝細(xì)胞模型。通過(guò)電鏡觀察及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平的檢測(cè)鑒定模型建立成功。對(duì)照組加入含10%胎牛血清的普通1640培養(yǎng)基。在模型組中分別添加含2.5、5、7.5mmol/l終濃度的二甲雙胍分別建立低、中、高劑量組，標(biāo)記為1、2、3組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。采用RT-PCR檢測(cè)L-02細(xì)胞PGC-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄，Western blot技術(shù)檢測(cè)L-02細(xì)胞PGC-1α蛋白質(zhì)的表達(dá)，采用甘油三酯（組織細(xì)胞）酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)L-02細(xì)胞中甘油三脂的變化，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定細(xì)胞MDA含量，采用黃嘌呤氧化物法測(cè)定細(xì)胞SOD活性。 結(jié)果 1.電鏡下觀察 對(duì)照組細(xì)胞中可見(jiàn)少量大小不等的脂滴，線粒體呈橢圓形或圓形，嵴膜清晰。模型組細(xì)胞中脂滴明顯增多（生化檢測(cè)示模型組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平明顯升高，說(shuō)明油酸誘導(dǎo)造模成功），少數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡樣改變。二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l（1組）、5mmol/l（2組）組細(xì)胞中可見(jiàn)脂滴分布，線粒體空泡樣改變有所減少。二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l（3組）組細(xì)胞中可見(jiàn)較少脂滴，線粒體稍腫脹，但線粒體嵴膜清晰。 2.細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平 與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；當(dāng)二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l時(shí)，細(xì)胞內(nèi)甘油三脂明顯減少，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l組比終濃度為2.5mmol/l組細(xì)胞內(nèi)甘油三脂明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）； 3.細(xì)胞內(nèi)MDA濃度和SOD活力 與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)MDA濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而SOD活力卻明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；與模型組相比，當(dāng)二甲雙胍終濃度為5mmol/l組、7.5mmol/l時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而SOD活力卻升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；與二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l組相比，當(dāng)二甲雙胍終濃度為5mmol/l、7.5mmol/l時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而SOD活力卻升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4.細(xì)胞PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平 與對(duì)照組相比，模型組L-02細(xì)胞中PGC-1α mRNA表達(dá)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與模型組相比，當(dāng)二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l、5mmol/l、7.5mmol/l時(shí)L-02細(xì)胞中PGC-1α mRNA表達(dá)量明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l組比終濃度為2.5mmol/l組細(xì)胞內(nèi)PGC-1αmRNA表達(dá)量明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.細(xì)胞PGC-1α蛋白質(zhì)表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組L-02細(xì)胞中PGC-1α蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與模型組相比，當(dāng)二甲雙胍終濃度為5mmol/l、7.5mmol/l時(shí)L-02細(xì)胞中PGC-1α蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6.相關(guān)性 肝細(xì)胞中PGC-1α表達(dá)水平與甘油三酯、MDA及SOD的相關(guān)性：L-02細(xì)胞中PGC-1α mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.581、-0.601，P0.05)；PGC-1α mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)MDA的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.629、-0.571，P0.05)；PGC-1α mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)SOD的水平呈相關(guān)(r=0.746、0.574，P0.05)。 結(jié)論 1、用20μg/ml油酸誘導(dǎo)L-02細(xì)胞可成功構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型。 2、PGC-1α表達(dá)水平降低可能在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。 3、二甲雙胍可改善NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。 4、二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PGC-1α的表達(dá)及氧化應(yīng)激水平從而減少脂肪堆積可能是用于非酒精性脂肪肝治療的分子機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2739578