【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是各種不同致病因子引起慢性肝病進而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑,是肝臟對各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復反應。其主要病理改變是細胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度合成與異常沉積。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)是參與該過程的最重要細胞,它的激活導致自身增殖和膠原合成增加被認為是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié),而肝纖維化恢復期HSC凋亡明顯增多。因此,抑制HSC活化、增殖或誘導其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關鍵所在。 第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因,可負性調(diào)控腫瘤細胞細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡,其缺失或表達異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。 近年來,對PTEN的研究已從腫瘤領域逐漸延伸至非腫瘤領域。研究表明,在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中,成纖維細胞的PTEN表達及其磷酸酶活力都低于正常肺成纖維細胞;并且其過表達或激活可抑制體外肺成纖維細胞增殖、誘導其凋亡。在有關PTEN與心肌纖維化的研究中也顯示PTEN基因敲除的小鼠心臟與體重之比增加、心肌纖維化程度明顯、心肌收縮性降低。這提示PTEN的低表達或失活參與了特發(fā)性肺纖維化及心肌纖維化的發(fā)生。而在PTEN與某些肝臟疾病的研究中,有研究發(fā)現(xiàn)特異性肝細胞PTEN缺失不僅可引起肝細胞癌而且還導致與肝纖維化密切相關的非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生。但迄今為止,PTEN在肝纖維化中的表達及作用,特別是對HSC增殖及凋亡的影響仍不清楚。為此,本研究應用膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型,探討PTEN在肝纖維化過程中的動態(tài)表達及其與在體HSC增殖、凋亡的關系;并進一步將攜帶野生型PTEN基因及其突變體G129E基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化HSC,觀察過表達的PTEN對活化HSC增殖、凋亡及細胞周期的影響,同時探討PTEN調(diào)控活化HSC增殖、凋亡及細胞周期的信號轉(zhuǎn)導機制,旨在為深入揭示肝纖維化的病理生理機制,尋求有效預防和治療肝纖維的新策略提供實驗依據(jù)。實驗內(nèi)容主要包括以下四部分: 第一部分PTEN在大鼠纖維化肝組織中的動態(tài)表達及其與在體肝星狀細胞增殖、凋亡的關系 目的:研究大鼠肝纖維化過程中肝組織的PTEN動態(tài)表達及其與在體HSC增殖、凋亡的關系。 方法:膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型,HE、Masson三色染色觀察肝臟病理組織學變化,免疫組織化學染色檢測大鼠肝組織中PTEN及α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的分布;免疫熒光雙標記共聚焦激光掃描顯微鏡技術測定大鼠肝組織中活化HSC的PTEN表達;末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記(TUNEL)及α-SMA免疫組織化學雙染檢測在體活化HSC的凋亡;Western blot和Real-time Q-PCR檢測大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達。 結(jié)果:①HE及Masson三色染色顯示,膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型成功建立,隨著造模時間延長肝纖維化程度逐漸加重。在造模不同時間均可見不同程度的肝細胞變性壞死而導致正常肝細胞逐漸減少。②α-SMA免疫組織化學染色顯示,正常大鼠肝組織中僅在血管壁平滑肌細胞有弱陽性表達;隨著肝纖維化的發(fā)展,大鼠肝組織中α-SMA陽性細胞逐漸增多,造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk不同時間大鼠肝組織α-SMA的陽性光密度值(0.16±0.01,0.17±0.01,0.21±0.01,0.26±0.02)均顯著高于假手術組(0.07±0.01), P0.01;且各組之間均有明顯差異(P0.01)。③TUNEL及α-SMA免疫組織化學雙重染色顯示,正常大鼠肝組織幾乎看不見凋亡HSC,隨著肝纖維化程度加重、活化HSC增多,凋亡HSC也增多,活化HSC與凋亡HSC共存。造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk不同時間大鼠肝組織HSC凋亡指數(shù)分別為4.57%±0.41%、4.02%±0.48%、3.45%±0.37%、2.88%±0.50%,即隨著肝纖維化程度加重,活化HSC凋亡指數(shù)逐漸減少(P0.01)。④PTEN免疫組織化學染色顯示,正常大鼠肝組織中PTEN蛋白有廣泛表達,主要表達于細胞漿,在胞核中也有表達;隨著肝纖維化的進展,大鼠肝組織中PTEN陽性細胞逐漸減少,主要分布于匯管區(qū)、纖維間隔及增生的膽管周圍細胞,PTEN蛋白的亞細胞定位沒有明顯變化。造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠肝組織PTEN的陽性光密度值(0.15±0.01,0.12±0.02,0.09±0.01,0.07±0.01)均顯著低于假手術組(0.21±0.02),P0.01;且各組之間均有明顯差異(P0.01)。⑤共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察PTEN和α-SMA免疫熒光雙標記的大鼠肝組織切片,單通道掃描可見PTEN和α-SMA陽性反應產(chǎn)物分別呈綠色和紅色熒光斑點狀,將單通道掃描的圖象混合后,在肝組織切片內(nèi)除了綠色和紅色熒光斑點外,還可見黃色熒光斑點,因為纖維化肝組織中只有活化HSC和少許血管平滑肌細胞表達α-SMA,故這些黃色斑點絕大部分可看做是PTEN和α-SMA在HSC的共表達產(chǎn)物,也就是活化HSC的PTEN陽性表達。共表達產(chǎn)物主要存在于活化HSC細胞漿,在部分細胞核中也有少許表達。圖像分析結(jié)果顯示,造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠肝組織中PTEN和α-SMA共存的HSC(PTEN表達陽性的活化HSC)占α-SMA表達陽性細胞(總的活化HSC)的比例分別為79.97%±5.49%、73.83%±5.04%、66.68%±4.58%、60.20%±4.65%。即隨著肝纖維化的進展,表達PTEN的活化HSC比例逐漸減少(P0.01)。⑥Western blot顯示,造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠纖維化肝組織PTEN蛋白表達量(1.20±0.13,1.07±0.16, 0.88±0.08,0.73±0.07)均顯著低于假手術組(1.37±0.14),P0.01;且各組之間均有明顯差異(P0.01),即大鼠肝纖維化越重PTEN蛋白表達越低。⑦應用Real-time Q-PCR技術檢測大鼠肝組織的PTEN mRNA表達,并采用相對定量2-△△Ct法比較PTEN mRNA在各組大鼠肝組織中的相對表達。以假手術組為對照組(其PTEN mRNA的表達量為1),則造模1 wk、2 wk、3 wk及4 wk大鼠纖維化肝組織中PTEN mRNA相對假手術組的表達倍數(shù)為0.66倍、0.53倍、0.44倍、0.37倍,均顯著低于假手術組,且隨著肝纖維化的發(fā)展逐漸下調(diào)(P0.01)。⑧Pearson’s相關性分析發(fā)現(xiàn),大鼠纖維化肝組織中PTEN表達與α-SMA表達呈顯著負相關,與PTEN陽性的活化HSC比例呈顯著正相關,與活化HSC凋亡指數(shù)呈顯著正相關,r值分別為-0.92、0.78、0.76,P0.01。 結(jié)論:膽總管結(jié)扎法成功建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型;大鼠肝纖維化形成過程中HSC的活化、增殖逐漸加快,而活化HSC的凋亡指數(shù)卻逐漸減少;隨著肝纖維化進展,大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達逐漸下調(diào),在體HSC的PTEN表達亦降低,其動態(tài)表達與在體HSC的活化、增殖呈顯著負相關,而與活化HSC凋亡指數(shù)呈顯著正相關。 第二部分PTEN對體外活化肝星狀細胞增殖與凋亡的影響 目的:探討過表達的野生型PTEN及其突變體G129E(喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性僅保留蛋白磷酸酶活性)對體外活化的HSC增殖、凋亡的影響及可能的機制。 方法:利用AD293細胞擴增實驗所需的腺病毒(Ad-PTEN、Ad-G129E、Ad-GFP),并測定滴度;以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化的HSC;Western blot及Real-time Q-PCR檢測HSC PTEN表達;MTT法檢測HSC增殖;TUNEL及碘化丙啶(propidium iodide, PI)標記的流式細胞術測定HSC凋亡;Western blot檢測HSC的凋亡調(diào)控基因Bcl-2及Bax表達。實驗分組如下:①Control組,僅以含8%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,在轉(zhuǎn)染步驟入無血清無抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-GFP組,轉(zhuǎn)染表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP;③Ad-PTEN組,轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達GFP的重組腺病毒Ad-PTEN;④Ad-G129E組,轉(zhuǎn)染攜帶PTEN的突變體G129E基因并表達GFP的重組腺病毒Ad-G129E。 結(jié)果:①通過反復感染AD293細胞的方法使病毒擴增獲得了實驗所需的病毒液(Ad-PTEN、Ad-G129E、Ad-GFP的滴度分別為1.2 x 109、1.5 x 109、1.8 x 109 pfu/ml)。②腺病毒感染HSC后72 h,應用Real time Q-PCR檢測活化HSC PTEN mRNA表達,并采用相對定量2-△△Ct法比較PTEN mRNA在各組HSC中的表達。以Control組為對照組(其PTEN mRNA表達量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組和Ad-G129E組相對Control組的PTEN mRNA表達倍數(shù)分別為0.993倍、1.569倍和1.561倍。很明顯,Ad-PTEN組及Ad-G129E組PTEN mRNA表達明顯高于Control組及Ad-GFP組(P0.01);而Ad-PTEN組與Ad-G129E組,以及Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。進一步應用Western blot分析各組HSC的PTEN蛋白表達,Ad-PTEN組(1.66±0.09)、Ad-G129E組(1.65±0.09)均顯著高于Control組(1.10±0.07)及Ad-GFP組(1.09±0.07),P0.01;而Control組與Ad-GFP組之間,以及Ad-PTEN組和Ad-G129E組之間均無明顯差異(P0.05)。證明野生型PTEN基因及其突變體G129E基因成功轉(zhuǎn)染入體外活化的HSC。③MTT檢測顯示,野生型PTEN基因及G129E基因轉(zhuǎn)染活化HSC后24 h對細胞增殖無明抑制(P0.05)。但在48 h、72 h HSC增殖受到明顯抑制,Ad-PTEN組增殖抑制率為14.03%、23.12%,而Ad-G129E組增殖抑制率是9.52%、12.63%(均以Control組為對照)。在各時間點,Ad-GFP組與Control組A值比較無明顯差異(P0.05)。顯然,野生型PTEN對HSC增殖的抑制作用明顯強于G129E。④TUNEL檢測發(fā)現(xiàn),在腺病毒感染HSC后72 h,Ad-PTEN組HSC凋亡率增至29.81%±2.52%,Ad-G129E組增至26.37%±1.97%均顯著高于Control組(1.98%±0.25%)及Ad-GFP組(2.16%±0.28%),P0.01;而Ad-PTEN組HSC凋亡率亦明顯高于Ad-G129E組(P0.01);Ad-GFP組與Control組比較無顯著差異(P0.05)。⑤PI標記的流式細胞術檢測顯示,Ad-PTEN組HSC凋亡率(20.84%±1.44%)、Ad-G129E組HSC凋亡率(17.54%±1.76%)均顯著高于Control組(1.12%±0.57%)及Ad-GFP組(1.21%±0.22%) , P0.01 ;而Ad-PTEN組亦明顯高于Ad-G129E組(P0.01);但Ad-GFP組與Control組比較無顯著差異(P0.05)。⑥Western blot檢測腺病毒感染HSC后72 h,各組HSC Bcl-2蛋白表達,Ad-PTEN組(1.16±0.03)、Ad-G129E組(1.24±0.05)均顯著低于Control組(1.37±0.06)及Ad-GFP組(1.34±0.08),P0.01,并且Ad-PTEN組較Ad-G129E組也明顯降低(P0.05),但Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05);而各組HSC Bax蛋白表達,Ad-PTEN組(1.50±0.05)、Ad-G129E組(1.41±0.05)均較Control組(1.28±0.06)及Ad-GFP組(1.26±0.08)顯著增高,P0.01,同時Ad-PTEN組明顯高于Ad-G129E組(P0.05),Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論:外源性野生型PTEN基因及G129E基因成功轉(zhuǎn)染體外活化HSC;其過表達可明顯抑制活化HSC增殖,誘導活化HSC凋亡,并引起HSC的凋亡調(diào)控基因Bax表達增加,Bcl-2表達下降。而且野生型PTEN的作用明顯強于G129E。 第三部分PTEN對體外活化肝星狀細胞細胞周期的調(diào)控作用 目的:探討過表達的野生型PTEN及其突變體G129E對體外活化HSC細胞周期的調(diào)控作用。 方法:體外培養(yǎng)活化的HSC,以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉(zhuǎn)染體外活化的HSC;流式細胞術測定HSC細胞周期時相;Western blot及Real-time Q-PCR檢測HSC的PTEN、細胞周期素D1(CyclinD1)、細胞周期素依賴性激酶4(Cyclin dependent kinase4, CDK4)及細胞周期素依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor, CDI)之一的P27kip1蛋白及mRNA表達。實驗分組同第二部分。 結(jié)果:①Real-time Q-PCR及Western blot檢測證實外源性野生型PTEN基因及其突變體G129E基因在體外活化HSC大量表達(結(jié)果同第二部分)。②流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,G0/G1期HSC細胞數(shù),Ad-PTEN組(67.68%±2.75%)、Ad-G129E組(61.17%±3.41%)均較Control組(53.01%±2.37%)及Ad-GFP組(53.85%±3.08%)明顯增高(P0.01) ,而Ad-PTEN組也明顯高于Ad-G129E組(P0.01);S期HSC細胞數(shù),Ad-PTEN組(14.42%±1.81%)、Ad-G129E組(18.17%±2.43%)均較Control組(22.17%±1.99%)及Ad-GFP組(21.54%±1.74%)明顯降低(P0.01) ,而Ad-PTEN組亦明顯低于Ad-G129E組(P0.01);G2/M期HSC細胞數(shù):Ad-PTEN組(17.90%±2.70%)、Ad-G129E組(20.66%±2.37%)均明顯低于Control組(24.82%±3.81%)及Ad-GFP組(24.62%±3.15%),P0.01、P0.05,而Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。此外,各期Control組與Ad-GFP組之間HSC細胞數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。③腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各組HSC cyclinD1蛋白表達,Ad-PTEN組(1.12±0.07)、Ad-G129E組(1.23±0.05)均較Control組(1.45±0.05)及Ad-GFP組(1.47±0.08)顯著降低(P0.01),Ad-PTEN組亦明顯低于Ad-G129E組(P0.01),而Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。進一步應用Real time Q-PCR檢測各組HSC cyclinD1 mRNA表達,并應用相對定量2-△△Ct法比較cyclinD1 mRNA在各組HSC中的相對表達。以Control組為對照組(其cyclinD1 mRNA表達量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組及Ad-G129E組相對Control組的cyclinD1 mRNA表達倍數(shù)分別為1.011倍、0.773倍和0.838倍。顯然,Ad-PTEN組及Ad-G129E組CyclinD1 mRNA表達明顯低于Control組及Ad-GFP組(P0.01),Ad-PTEN組較Ad-G129E組也顯著降低,而Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。④腺病毒感染HSC后72 h,Western blot檢測各組HSC CDK4蛋白表達,Ad-PTEN組(1.05±0.07)、Ad-G129E組(1.18±0.06)均較Control組(1.41±0.03)及Ad-GFP組(1.43±0.06)顯著降低(P0.01),而Ad-PTEN組亦明顯低于Ad-G129E組(P0.01),但Control組與Ad-GFP組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。進一步應用Real time Q-PCR檢測各組HSC的CDK4 mRNA表達,并應用相對定量2-△△Ct法比較CDK4 mRNA在各組HSC中的相對表達。以Control組為對照組(其CDK4 mRNA表達量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組及Ad-G129E組相對Control組的CDK4 mRNA表達倍數(shù)為1.007倍、0.738倍和0.822倍。顯然,Ad-PTEN組、Ad-G129E組CDK4 mRNA表達較Control組及Ad-GFP組明顯降低(P0.01),Ad-PTEN組也顯著低于Ad-G129E組(P0.01),但Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。⑤腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各組HSC P27kip1蛋白表達,Ad-PTEN組(1.40±0.03)、Ad-G129E組(1.28±0.08)均顯著高于Control組(1.11±0.04)及Ad-GFP組(1.12±0.04),P0.01,Ad-PTEN組較Ad-G129E組亦明顯升高(P0.01),但Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。進一步應用Real time Q-PCR檢測各組HSC P27kip1 mRNA表達,并應用相對定量2-△△Ct法比較P27kip1 mRNA在各組HSC中的表達。以Control組為對照組(其P27kip1 mRNA表達量為1),則Ad-GFP組、Ad-PTEN組和Ad-G129E組相對Control組的P27kip1 mRNA表達倍數(shù)為1.008倍、1.264倍和1.157倍�？梢钥闯�,Ad-PTEN組、Ad-G129E組P27kip1 mRNA表達明顯高于Control組及Ad-GFP組(P0.01),Ad-PTEN組也較Ad-G129E組顯著升高(P0.01),而Control組與Ad-GFP組之間無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論:過表達的野生型PTEN及G129E顯著抑制體外活化HSC細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化,阻滯HSC細胞周期時相于G0/G1期;同時在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上下調(diào)活化HSC的cyclinD1、CDK4表達,上調(diào)P27kip1表達,這可能是其阻滯活化HSC細胞周期進程的重要機制。并且,在上述作用中野生型PTEN明顯強于G129E。 第四部分PTEN調(diào)控活化肝星狀細胞行為的信號轉(zhuǎn)導機制 目的:探討PTEN調(diào)控活化肝星狀細胞增殖、凋亡及細胞周期的信號轉(zhuǎn)導機制。 方法:體外培養(yǎng)活化HSC,以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉(zhuǎn)染體外活化HSC;Western blot檢測HSC的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)、p-Akt(Thr308)、細胞外信號調(diào)節(jié)激1(extracellular signal-regulated kinase1, ERK1)、p-ERK1蛋白表達;Real-time Q-PCR檢測Akt、ERK1 mRNA表達。實驗分組同第二部分。 結(jié)果:①Real-time Q-PCR及Western blot檢測證實外源性野生型PTEN基因及其突變體G129E基因在體外活化HSC大量表達(結(jié)果同第二部分)。②腺病毒感染HSC后72 h,Western blot及Real-time Q-PCR顯示野生型PTEN及G129E對HSC Akt蛋白及其mRNA表達均無明顯影響(P0.05);而Western blot顯示Ad-PTEN組p-Akt(Thr308)蛋白表達(0.63±0.04)顯著低于Ad-G129E組(0.93±0.03)、Control組(0.95±0.04)及Ad-GFP組(0.94±0.03),P0.01,但Ad-G129E組、Control組及Ad-GFP組之間p-Akt(Thr308)表達無顯著差別(P0.05)。③腺病毒感染HSC后72 h,Western blot及Real-time Q-PCR顯示野生型PTEN及G129E對HSC ERK1蛋白及mRNA表達均無明顯影響(P0.05);而Western blot顯示Ad-PTEN組p-ERK1蛋白表達(0.65±0.04)、Ad-G129E組p-ERK1蛋白表達(0.68±0.07)均顯著低于Control組(0.84±0.07)及Ad-GFP組(0.85±0.06),P0.01,但Ad-PTEN組與Ad-G129E組,以及Control組與Ad-GFP組之間p-ERK1表達無顯著差異(P0.05)。 結(jié)論:PTEN通過其磷酸酶活性抑制Akt及ERK1的磷酸化;其負性調(diào)控活化HSC細胞周期、抑制活化HSC增殖及誘導活化HSC凋亡的作用與PI3K/Akt、ERk1/2信號通路的活性抑制有關。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2

【引證文獻】

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1 楊念;中藥復方T11治療慢性肝損傷的藥效學研究[D];吉林大學;2012年

本文編號：2729609