【摘要】：背景：肝纖維化是由各種致病因子所引起的組織修復(fù)過程,主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)過度沉積,它是肝硬化乃至肝癌共同的病理基礎(chǔ)。因此,探尋有效治療肝纖維化的方法是非常必要和迫切的。近年來,許多研究證實肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的,對抗肝纖維化藥物的研究也取得了一定的進展,但肝纖維化發(fā)生機制復(fù)雜,而著眼于阻斷發(fā)病機制某一環(huán)節(jié)的藥物治療見效不大。本研究小組前期應(yīng)用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、�；撬�(Taurine)和三羥基異黃酮(Genistein)三種具有不同抗纖維化作用機理的藥物聯(lián)合組成雞尾酒(Cocktail)進行了一系列體內(nèi)外實驗,發(fā)現(xiàn)其具有抗肝纖維化作用。 目的：本研究運用iTRAQ技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,研究雞尾酒作用肝星狀細胞株HSC-T6后,細胞的整體蛋白表達水平發(fā)生的變化,分析和鑒定細胞中差異表達的蛋白質(zhì),從蛋白質(zhì)水平探討雞尾酒療法抗肝纖維化的作用機理,以期為肝纖維化的診斷、治療和預(yù)后尋找可靠的生物標志物。 方法：以HSC-T6作為靶細胞,經(jīng)Cocktail作用后,采用MTT法測定藥物對細胞增殖的影響,確定Cocktail對HSC-T6增殖抑制的最佳濃度；然后提取Cocktail最佳濃度作用下肝星狀細胞株HSC-T6的細胞總蛋白,用bradford法定量蛋白質(zhì)濃度；取等量蛋白用胰蛋白酶(Trypsin)酶解,再以同位素標簽的iTRAQ標記蛋白質(zhì)肽段,經(jīng)陽離子柱(SCX)分離后,利用LC-ESI-MS/MS進行質(zhì)譜檢測差異表達的蛋白質(zhì),后采用Mascot進行IPI大鼠蛋白數(shù)據(jù)庫搜索鑒定蛋白質(zhì),運用生物信息學(xué)分析差異表達的蛋白質(zhì)功能。 結(jié)果：(1)雞尾酒療法對HSC-T6增殖有抑制作用,cocktail低、中、高劑量組與對照組的A值比較有顯著性差異(0.12210.009,0.154±0.016,0.187±0.052VS0.223±0.032, P0.05),中劑量與低劑量之間無顯著差異(P0.05),低劑量、中劑量與高劑量組間有顯著差異(P0.05)；(2)質(zhì)譜共鑒定分析出727種蛋白質(zhì)。根據(jù)當?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達到1.2倍以上,且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其p-value值小于0.05時,視為差異蛋白。與對照組相比,三次生物學(xué)重復(fù)鑒定到的差異蛋白數(shù)量分別：第一次實驗共發(fā)現(xiàn)285種差異表達的蛋白質(zhì),其中119種蛋白質(zhì)上調(diào),166種蛋白質(zhì)下調(diào)；第二次重復(fù)實驗時共找到331種差異表達蛋白質(zhì),其中126種蛋白質(zhì)上調(diào),205種蛋白質(zhì)下調(diào)；第三次重復(fù)實驗時發(fā)現(xiàn)330種差異表達蛋白質(zhì),130種蛋白質(zhì)上調(diào),200種蛋白質(zhì)下調(diào)。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),三次生物學(xué)重復(fù)均鑒定到的差異蛋白為36個,其中表達上調(diào)的差異蛋白有11個,表達下調(diào)的差異蛋白有25個。通過對這些差異蛋白進行蛋白質(zhì)功能分析,發(fā)現(xiàn)其參與翻譯后修飾、轉(zhuǎn)錄、重組和信號傳導(dǎo)通路等過程。 結(jié)論：(1)雞尾酒療法具有抑制HSC-T6增殖的作用,Cocktail低劑量組(taurine15μg/ml+EGCG17.5μg/ml+genistein3.5μg/ml)具有較好的抑制作用；(2)絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1、半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑1、層粘連蛋白等可能參與Cocktail對HSC-T6的抗纖維化作用；(3)半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑1可作為肝纖維化早期診斷候選標志物。(4)雞尾酒療法的抑制HSC-T6增殖及抗纖維化的作用,可能是通過對蛋白進行調(diào)控表達來實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2

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本文編號：2721646