【摘要】： 肝臟疾病嚴重威脅著人類身體健康,目前可行的治療方案主要有以下兩種:肝臟移植與肝細胞移植。這兩種治療方式雖能明顯改善患者癥狀,但也存在很多問題:如肝臟器官移植受到供體器官匱乏、高額費用和長期需要使用免疫抑制劑的限制;肝細胞移植后機體易于產生明顯免疫排斥反應,從而導致移植最終失敗。因此,如何尋求新的治療技術和方法來解決上述問題,逐漸引起國內外研究人員的廣泛關注,組織工程學的出現為肝病的治療帶來了希望。 組織工程作為一門以“制造和替代人體組織和器官”為主要目的的交叉學科,在過去二十余年發(fā)展過程中,先后在皮膚、軟骨、神經、血管等組織再造領域取得明顯進展,部分組織工程產品已進入市場。針對肝臟的組織工程研究近年來已成為組織工程的熱點領域,發(fā)展尤為迅速,并取得了一系列突破性進展,研究人員利用膠原、殼聚糖、海藻酸鈉等為支架,先后成功在體外再造了工程化肝臟組織。盡管如此,肝臟組織工程研究仍面臨著許多問題和挑戰(zhàn),例如:如何提高再造肝臟組織的血管化能力以及體內移植后如何避免宿主的免疫排斥反應等。 本論文分別以膠原/Matrigel和海藻酸微囊作為細胞支架材料,在體外構建了三維立體肝臟組織片層以及微囊化肝細胞,并通過在肝細胞-材料復合體中進一步添加血管內皮細胞的方式,促進再造肝臟組織的血管化。研究結果表明,膠原/Matrigel是肝細胞良好的支架材料,肝細胞在材料內能夠形成肝臟組織,并且發(fā)現在肝組織片層中有管腔樣結構出現,證實了血管內皮細胞對肝細胞功能的促進作用。在微囊化肝細胞研究方面,本論文基于微囊的免疫隔離作用,用微囊共包裹肝細胞與血管內皮細胞并對肝衰竭大鼠進行移植治療,通過對大鼠死亡率和肝功能的檢測后發(fā)現,微囊共包裹肝細胞與血管內皮細胞可以明顯改善肝衰竭大鼠的肝功能,血管內皮細胞的加入對于微囊化肝細胞發(fā)揮生物學功能起到了積極作用。 本論文從三維立體肝臟組織再造到微囊化肝細胞研究,主要研究內容包括以下五個部分: 第一部分:基于膠原/Matrigel的組織工程化肝臟片層體外構建研究 本部分實驗首先通過改良的膠原酶消化法,原代分離培養(yǎng)鑒定了大鼠肝細胞,并將其培養(yǎng)于膠原/Matrigel基質環(huán)境中,構建了組織工程化肝臟片層。通過觀察細胞形態(tài)、檢測細胞間的連接以及肝細胞的白蛋白分泌,并與膠原三明治結構相比較,研究發(fā)現構建的肝臟片層中細胞聚集生長,狀態(tài)良好,并且表達actin和E-cadherin連接蛋白,白蛋白的分泌也顯著高于三明治結構,說明膠原/Matrigel基質的三維立體環(huán)境更有利于肝細胞的生長和功能的發(fā)揮,體外再造的三維立體肝臟組織對于肝臟疾病的治療及相關基礎性研究具有重要作用。 第二部分:基于膠原/Matrigel的肝細胞與血管內皮細胞三維立體共培養(yǎng)體系的建立 本部分實驗將肝細胞和血管內皮細胞共培養(yǎng)于膠原/Matrigel基質環(huán)境中,構建了肝細胞/血管內皮細胞片層,觀察片層中細胞的形態(tài)、對細胞進行H.E.染色和免疫熒光染色,并且在體外培養(yǎng)1、3、5、7、14d時,更換培養(yǎng)液,收集培養(yǎng)上清,檢測上清培養(yǎng)液中的白蛋白分泌水平。結果可見肝細胞/血管內皮細胞片層中的細胞逐漸聚集生長,組織學檢測發(fā)現血管內皮細胞遷移聚集,形成管腔樣結構。與單純肝細胞片層相比,肝細胞/血管內皮細胞片層組培養(yǎng)液中的白蛋白分泌水平明顯高于單純肝細胞組。 第三部分:微囊材料的制備及其生物學性能評價 在海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微囊的制備基礎之上,用Ba2+代替Ca2+,制備出海藻酸鋇-聚賴氨酸-海藻酸(BPA)微囊,并采用機械震蕩法測定APA和BPA微囊的機械強度和體外模擬體液法長期培養(yǎng)測定APA和BPA微囊的滲透壓強度,結果表明,BPA微囊比APA微囊具有較高的機械強度和長期穩(wěn)定性。采用體內移植實驗測定微囊在肌肉內的移植強度,結果表明,APA和BPA微囊纖維化程度不明顯。但是,APA微囊移植后體積膨脹率較BPA微囊略大,且成多邊形態(tài),而BPA微囊的形態(tài)多近似球形。采用腹腔移植實驗測定微囊的生物相容性,結果表明,大鼠腹腔移植BPA微囊和APA微囊后第7、14、28和56d時,回收的微囊體積均占植入微囊體積的90%以上,光鏡下見回收的兩種微囊絕大部分仍呈完整的球形,表面光滑,無細胞包裹,纖維化程度不明顯。 第四部分:微囊化肝細胞生物學性能的體外評價 制備BPA微囊化肝細胞,通過對微囊化肝細胞進行組織學檢測、Live/Dead染色以及測定白蛋白分泌水平,體外評價了肝細胞的活性和功能,結果發(fā)現,在培養(yǎng)過程中光鏡可見微囊和肝細胞均保持完整形態(tài);組織學染色與Live/Dead染色結果顯示微囊內大多數肝細胞仍保持較好活性,肝細胞在BPA微囊內培養(yǎng)7d內能夠維持穩(wěn)定的白蛋白分泌水平,表明BPA微囊是一種適合于肝細胞生長的微囊材料。 第五部分:微囊共包裹肝細胞和血管內皮細胞移植治療大鼠肝衰竭的實驗研究 采用D-氨基半乳糖腹腔注射法建立大鼠急性肝衰竭模型,經腹腔移植空微囊、游離的肝細胞、微囊化肝細胞和共包裹肝細胞和血管內皮細胞四個實驗組治療肝衰竭大鼠,于移植后的1d、3d、5d、1w、2w、3w、4w眼眥靜脈取血,測血液中谷丙轉氨酶(ALT),谷草轉氨酶(AST),白蛋白(ALB)水平,通過對回收微囊的形態(tài)學檢測和肝衰竭大鼠肝功能檢測發(fā)現,移植4w后回收的BPA微囊形狀完好,纖維化程度不明顯,H.E.染色結果表明移植4w后囊內的肝細胞形態(tài)依舊完整,充分說明了BPA微囊本身的免疫隔離作用保護了肝細胞在移植體內的功能發(fā)揮。移植4w內共包裹組明顯改善了肝衰竭大鼠的肝功能,其中移植后2到4周,共包裹組大鼠的ALT、AST與ALB水平顯著優(yōu)于其他各組;此外,共包裹組肝衰大鼠死亡率降低,與單純包裹肝細胞組相比,其第四周死亡率由50%減少到20%,表明共包裹組中血管內皮細胞維持了肝細胞的活性和功能,延長了肝細胞的存活時間,對大鼠肝衰竭的治療起到了促進作用。 綜上所述,本研究首先在體外構建了組織工程化肝細胞片層,并研究了膠原/Matrigel凝膠環(huán)境對于肝細胞的活性和功能發(fā)揮的促進作用,在此基礎上,利用本支架材料體系探討了肝細胞與血管內皮細胞的相互作用以及血管內皮細胞對肝細胞功能的促進作用�；谏鲜黾毎飳W研究基礎,并利用以往已經建立的微囊化人工細胞的研究平臺,進一步研制了具有免疫隔離作用的BPA微囊材料,體外評價了BPA微囊化肝細胞的生物學功能,并共包裹了肝細胞和血管內皮細胞,移植治療大鼠急性肝衰竭,結果發(fā)現由于微囊可以避免免疫排斥反應,共包裹的細胞對肝衰竭大鼠有明顯的治療作用,血管化微囊化肝細胞對于肝衰竭臨床治療具有潛在的應用前景。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575.3
【圖文】：

第一部分：基于膠原/Matrigel 的組織最終比例為 5：4：1；（2）收集原代大鼠肝細胞與上述液態(tài)膠原/Matrigel 的接種密度分別為 2×106個/mL；（3）將肝細胞與膠原/Matrigel 混合物每孔各注入 1m（4）將肝細胞與膠原/Matrigel混合物置于5%CO2、37后，觀察混合物凝固后，每孔添加 2mLWilliam’s E 培養(yǎng)前三步的操作必須在冰盒上進行，否則混合物會過早液，此后隔天更換培養(yǎng)液。（圖 1-1）2.6 肝細胞三明治結構的構建將 1mLⅠ型膠原/Matrigel 凝膠鋪于 6 孔板底，置于孵育 2h，然后加入 2×106肝細胞，孵箱培養(yǎng) 1d 后吸出培/Matrigel 凝膠，每天換培養(yǎng)液，收集更換的培養(yǎng)液保存在

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本文編號：2717086