【摘要】：第一部分單核細(xì)胞分泌GRN活化HSCs促進(jìn)肝纖維化機(jī)制研究目的:肝纖維化(liver fibrosis)是多種慢性肝病進(jìn)展的共同病理過程,是我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近年來研究表明巨噬細(xì)胞,特別是單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)肝纖維化,但其機(jī)制仍不清楚。最新研究顯示巨噬細(xì)胞可以分泌顆粒體蛋白(granulin,GRN)促進(jìn)纖維化。本研究旨在揭示巨噬細(xì)胞及GRN促進(jìn)肝纖維化的機(jī)制,為肝纖維化的治療尋求新的靶點(diǎn)。方法:首先我們檢測了121例慢性肝病患者CLD肝臟中GRN表達(dá),分析GRN與肝臟炎癥、纖維化、臨床肝病指標(biāo)的關(guān)系,以及在不同原因肝病患者中的表達(dá)差異;然后,我們通過腹腔反復(fù)注射CCl4和膽管結(jié)扎的方式建立小鼠肝纖維化模型,檢測不同纖維化模型小鼠不同時期肝臟中GRN表達(dá)變化;利用GRN-/-小鼠建立肝纖維化模型,探索GRN對肝纖維化的作用;利用GRN與肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)系-LX-2共培養(yǎng),通過q-PCR檢測平滑肌肌動蛋白α2(smooth muscle actin alpha 2,ACTα2)和I型膠原α1(collagen type I alpha l,Collα1)等指標(biāo),觀察GRN對HSCs活化的影響,通過WB檢測ERK1/2、P-38、JNK、AKT和NF-κB等蛋白表達(dá)和磷酸化水平,探索GRN活化HSCs的機(jī)制;利用GRN與巨噬細(xì)胞表面分子CD68、F4/80和CD11b熒光共染,觀察在肝纖維化期肝臟中GRN表達(dá)來源;利用脂質(zhì)體尾靜脈注射去除掉小鼠肝巨噬細(xì)胞,觀察去除掉巨噬細(xì)胞后小鼠肝臟中GRN表達(dá);利用野生型小鼠和GRN-/-小鼠的骨髓單核細(xì)胞和肝臟原代HSCs共培養(yǎng),觀察單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞對小鼠肝星狀細(xì)胞的活化作用。結(jié)果:在CLD患者肝臟中GRN表達(dá)較普通人明顯升高,且與肝臟炎癥呈正相關(guān),不同病因之間無明顯差異。與CLD患者肝臟臨床指標(biāo)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),肝組織內(nèi)中GRN+細(xì)胞數(shù)量與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)、總膽紅素(total bilirubin,Tbill)、Child-Pugh評分呈正相關(guān),與白蛋白水平無明顯的相關(guān)性。在CC14腹腔反復(fù)注射和膽管結(jié)扎這兩種小鼠肝纖維化模型中,GRN表達(dá)隨著CC14腹腔注射次數(shù)增加和膽管結(jié)扎時間延長明顯增加。在CC14腹腔反復(fù)注射建立小鼠肝纖維化模型中,與野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠肝臟中α-SMA和Col-1表達(dá)明顯減輕,炎癥因子白介素(interleukin,IL)-4和IL-10降低。GRN與LX-2共培養(yǎng)后,LX-2表達(dá)ACTα2和Collαl明顯增加,而且ERK1/2和STAT3磷酸化水平明顯增加。在CLD患者肝組織免疫熒光中,GRN與CD68共染較普通人明顯增多。在普通小鼠肝臟中GRN主要與F4/80熒光共染,而纖維化小鼠模型中GRN與CD11b共染明顯增多。相比于普通人CLD患者肝組織切片顯示,CD68+細(xì)胞數(shù)量明顯升高。肝纖維化小鼠模型中,F4/80+和CD11b+細(xì)胞數(shù)量也較空白對照組明顯升高。與野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠骨髓單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞活化HSCs作用明顯減輕。結(jié)論:肝纖維化過程中,GRN表達(dá)明顯升高,與肝臟炎癥和纖維化密切相關(guān)。拮抗GRN作用后,HSCs活化減輕和肝纖維化緩解。而GRN活化HSCs的作用,與ERK1/2和STAT3磷酸化有關(guān)。肝纖維化過程中,GRN主要由單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞分泌。單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞可以通過分泌GRN促進(jìn)HSCs活化,加重肝纖維化。第二部分姜黃素抑制單核細(xì)胞浸潤減輕肝纖維化的機(jī)制研究目的:既往研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有良好的抗肝纖維化作用,但其作用機(jī)制尚不清楚。近年來有研究顯示姜黃素具有抑制趨化因子分泌和單核細(xì)胞浸潤的作用。在本研究中,我們旨在研究姜黃素是否可以通過抑制庫普弗細(xì)胞(Kupffer cells,KCs)活化來減少趨化因子的分泌,從而抑制Ly6Chi單核細(xì)胞浸潤以及Ly6Chi單核細(xì)胞相關(guān)的促纖維化細(xì)胞因子分泌來緩解肝纖維化。方法:24只小鼠被隨機(jī)分為三組:空白組、CCl4組和姜黃素組。其中CCl4組和姜黃素組予以CCl4腹腔注射,每周兩次,連續(xù)四周�？瞻捉M小鼠相應(yīng)予以橄欖油腹腔注射。CMC-NA溶液重懸姜黃素。姜黃素組小鼠每日予以姜黃素灌胃,連續(xù)四周,空白組和CCl4組予以相應(yīng)體積的CMC-NA溶液灌胃。結(jié)果:姜黃素給藥后,纖維化模型小鼠肝臟炎癥和纖維化明顯減少。與CCl4組比較,姜黃素組小鼠Ly6Chi單核細(xì)胞的肝內(nèi)浸潤明顯減少,但其他白細(xì)胞亞型無差異。姜黃素顯著降低Ly6Chi單核細(xì)胞相關(guān)促炎性和促纖維化細(xì)胞因子分泌,與肝內(nèi)Ly6Chi單核細(xì)胞數(shù)量減少相一致。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠降低KCs活化和肝內(nèi)單核細(xì)胞趨化因子分泌,這解釋了姜黃素為什么可以減少肝纖維化過程中的Ly6Chi單核細(xì)胞浸潤。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制巨噬細(xì)胞向M1型的極化,減少單核細(xì)胞趨化因子MCP-1和CCL7的分泌。這與姜黃素抑制ERK1/2和p38通路蛋白磷酸化有關(guān)。結(jié)論:綜上所述,我們首次證實(shí)姜黃素可以通過抑制KCs活化來減少趨化因子的分泌,從而抑制Ly6Chi單核細(xì)胞浸潤以及Ly6Chi單核細(xì)胞相關(guān)的促纖維化細(xì)胞因子分泌來緩解肝纖維化。這些結(jié)果提示姜黃素可以作為預(yù)防和治療肝纖維化的候選藥物。
【圖文】：

逑１．２邋ＣＬＤ患者肝組織ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤情況逡逑利用免疫組化的方法，，我們檢測了邋ＣＬＤ患者肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤情況。如圖１－１Ａ逡逑所示，普通人肝組織內(nèi)可見肝竇內(nèi)散在分布的ＧＲＮ＋染色細(xì)胞，匯管區(qū)周圍無陽性染色細(xì)逡逑胞。而ＣＬＤ患者肝組織內(nèi)也可見肝竇內(nèi)散在分布的ＧＲＮ＋染色細(xì)胞，但是在匯管區(qū)內(nèi)可見逡逑大量的ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤。對ＣＬＤ患者肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可見ＣＬＤ患者肝組逡逑織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞數(shù)量（１０５．２３±１０．２２／每高倍視野（ＨＰＦ））較普通人肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞數(shù)逡逑量（４０．３３±３．７６／ＨＰＦ）明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖１－１Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ＨＣ（ＳＯＧＯ）邐ＣＬＤ（Ｓ４Ｇ４）逡逑廔．邋琢－邐２５0１邐＇￣￣￣Ｔ＂逡逑｜邋－邋■邋■逡逑ｚ邐｜邐ｉ１５０－逡逑Ｊ邐（、ｉ１００－逡逑／邐＼邐ＨＣ（ｎ＝３０）邐ＣＬＤ（ｎ＝１２１）逡逑＋ｆ．逡逑－邋？＇？：ｖ邋ｖ逡逑．丨丨邐ｉ逡逑圖１－１．邋ＣＬＤ患者肝組織和正常肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤。Ａ．邋ＣＬＤ患者肝組織和正常肝逡逑組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞免疫組化示意圖；Ｂ．邋ＣＬＤ患者肝組織和正常肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤陽逡逑性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。＊Ｐ＜0．0５，＊＊尸＜０．０１。標(biāo)尺長度：５０ｆｍｕ逡逑１．３不同病因ＣＬＤ患者肝組織ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤情況比較逡逑如圖１－２所示

逡逑圖１－２．不同病因的ＣＬＤ患者肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋細(xì)胞比較，＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑１．４邐ＣＬＤ患者肝組織中ＧＲＮ＋細(xì)胞浸潤與肝組織炎癥分級和纖維化分期的關(guān)系逡逑我們進(jìn)一步分析ＧＲＮ＋細(xì)胞與不同程度的肝臟炎癥和纖維化程度的關(guān)系。如圖１－３所逡逑示，１２１例ＣＬＤ患者中，Ｇ１級患者５４例，Ｇ２級患者３５例，Ｇ３級患者２０例，Ｇ４級患逡逑者１２例。隨著Ｇ分級的增高，ＣＬＤ患者肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋比例明顯逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)逡逑學(xué)意義。１２１例ＣＬＤ患者中，Ｓ０－１期患者５９例，Ｓ２期患者１１例，Ｓ３期患者２０例，Ｓ４逡逑期患者３１例。如圖１－３所示，與普通人相比，不同纖維化分期的ＣＬＤ患者，肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋逡逑細(xì)胞的數(shù)量均較正常對照組明顯增多。而不同纖維化分期ＣＬＤ患者之間肝組織內(nèi)ＧＲＮ＋逡逑細(xì)胞數(shù)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑｜｜邐＊＊＊＊＊＊邐＊＊逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐２５０－，邋Ｉ邐１邐１邐１邐１逡逑２５0邋｜邐＊＊邐？邐２５０邋｜邐－邋？逡逑％邋２００－邋Ｉ邋Ｉ邋１邐｜邋２００＇邐■邐？？逡逑ｉ邋很－＿Ｉ，邐＇邐？邋＾邐Ｉ１５０－邐■■■邋４邐%煎危�？辶x希板危垮危殄危潁咤危懾危殄危咤危危卞危卞危卞危卞義希齲緬危牽希卞危牽插危牽沖危牽村危齲緬危櫻埃卞危櫻插危櫻沖危櫻村義賢跡保常澹茫蹋幕頰卟煌字⒎旨逗拖宋制詬巫櫓冢牽遙危赴勘冉

本文編號：2709409