【摘要】： 研究背景 乙型肝炎病毒(HBV)感染是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病。它可導(dǎo)致各種急、慢性疾病,包括致命的重型肝炎、肝硬化和肝細胞癌等。目前治療慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒藥物主要有干擾素及核苷(酸)類似物兩大類。核苷(酸)類似物進入體內(nèi)后通過競爭摻入,取代病毒復(fù)制過程中延長聚合酶鏈所需的與之結(jié)構(gòu)相似的核苷酸,由于核苷(酸)類似物缺乏3′端羥基而不能繼續(xù)延伸DNA鏈,從而抑制病毒復(fù)制。但是由于核苷(酸)類似物對作為復(fù)制模板的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)無作用,核苷(酸)類似物僅能抑制HBV復(fù)制而不能完全清除HBV,因此CHB患者需要長時間服用核苷(酸)類似物治療以抑制病毒復(fù)制。然而長期服用核苷(酸)類似物有可能出現(xiàn)病毒變異而導(dǎo)致耐藥問題。其耐藥的基礎(chǔ)是復(fù)制過程中,HBV需要利用自身的DNA聚合酶將前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,由于HBV聚合酶沒有校正活性,容易出現(xiàn)錯配而導(dǎo)致突變。核苷(酸)類似物作用于HBV的聚合酶區(qū),而聚合酶區(qū)基因突變可能導(dǎo)致某些特定部位的氨基酸被置換,使之與藥物的結(jié)合力下降,從而出現(xiàn)藥物敏感性降低和耐藥。拉米夫定耐藥的變異為HBV DNA聚合酶基因P區(qū)第739個核苷酸A突變?yōu)镚,使第204位的蛋氨酸被纈氨酸替代(rtM204V),即YMDD突變?yōu)閅VDD,且往往同時還伴有第180位的亮氨酸被蛋氨酸所置換(rtL180M)的變異。核苷(酸)類似物耐藥為目前慢性乙型肝炎抗病毒治療中所面臨的主要難題之一,因此有必要建立核苷(酸)類似物耐藥模型用于抗病毒藥物的開發(fā)、篩選、耐藥機理的研究。由于HBV感染有高度的種屬和組織特異性,僅感染人和猩猩,而猩猩價格昂貴,來源困難,故動物模型缺乏。在HBV相關(guān)研究中,多使用轉(zhuǎn)基因動物模型和體外細胞模型。轉(zhuǎn)基因動物模型由于動物本身的免疫狀態(tài)及遺傳背景尚不十分明確,其使用受到限制。目前體外細胞培養(yǎng)模型主要有三大類:第一類是HBV直接感染細胞模型;第二類是不產(chǎn)生基因整合的瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型;第三類是HBV基因與細胞基因組基因整合并持續(xù)產(chǎn)生HBV顆粒的穩(wěn)定表達細胞株。感染模型的細胞來源困難,難以長期培養(yǎng),使用較少。瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型缺點仍為不能長期培養(yǎng),同時受實驗條件影響大�；谀退幯芯�、藥物篩選及評價方面的考慮,細胞模型需要穩(wěn)定分泌出耐藥HBV病毒顆粒。目前國外已有構(gòu)建此類細胞株及相關(guān)的研究,但尚無公認、廣泛使用的商品化穩(wěn)定表達耐藥HBV細胞株,因此有必要建立穩(wěn)定表達耐藥HBV體外細胞模型。 將DNA有效整合入細胞基因組,其方法主要有非病毒載體法及病毒載體法。前者包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電擊穿孔法及顯微注射法等,這些方法得到穩(wěn)定細胞株的效率相當(dāng)?shù)�。后者主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體等方法。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及慢病毒載體對目的基因轉(zhuǎn)移效率高,容易得到穩(wěn)定表達株。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基于逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建的病毒載體。在構(gòu)建時,刪去了pol、env和gag基因,保留了5'端和3'端的LTR及包裝信號ψ序列,并增加了多克隆位點、抗性標(biāo)記,與質(zhì)粒拼接而成。而病毒顆粒識別、包裝等過程所必須的gag、pol與env基因整合在相應(yīng)的包裝細胞基因組內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞后,將載體DNA插入包裝細胞基因組。載體DNA轉(zhuǎn)錄出含標(biāo)記基因、目的基因、包裝信號的RNA序列,結(jié)合包裝細胞內(nèi)已提供gag、pol與env蛋白,包裝出有感染能力的假病毒顆粒。這種假病毒顆�？筛腥景屑毎�,并將整條病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA上,使之成為其一部分,并能穩(wěn)定表達目的基因。 研究目的 構(gòu)建含rtM204V、rtL180M突變位點的拉米夫定耐藥1.3拷貝HBV基因及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的方法建立表達YMDD變異HBV的穩(wěn)定細胞株,并進一步鑒定所構(gòu)建細胞株HBV復(fù)制及抗原表達情況。通過本研究探索構(gòu)建其他核苷(酸)類似物耐藥HBV穩(wěn)定細胞株的方法。 研究方法 1.使用突變引物YVS、YVA對重組桿狀病毒載體上的1.3拷貝野生株HBV的進行rtM204V定點突變。通過突變引物526MS、526MA對目的基因進行rtL180M位點突變。PCR-RFLP鑒定突變是否成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時轉(zhuǎn)染細胞以測定目的基因復(fù)制活性。 2.攜帶1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組桿狀病毒載體質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2分別進行HindⅢ、SalⅠ雙酶切。純化回收目的片段進行連接,獲得含反向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRV-oYVDDHBV。通過引物HSS和HSA擴增出1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因,并使得PCR產(chǎn)物5'端帶有HindⅢ位點,3'端帶有SalⅠ位點,經(jīng)酶切、連接后獲得含正向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRV-YVDDHBV。使用酶切、PCR及測序的方法鑒定所構(gòu)建重組載體。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PT67包裝細胞,含G418培養(yǎng)基壓力篩選后挑取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆,獲得含病毒培養(yǎng)上清。 4.倍比稀釋含重組病毒顆粒的包裝細胞培養(yǎng)上清,梯度濃度的含病毒上清感染NIH3T3細胞,含G418培養(yǎng)基壓力篩選,以確定病毒滴度。取經(jīng)感染并篩選后仍存活的NIH3T3細胞,其培養(yǎng)上清再次感染新復(fù)蘇的NIH3T3細胞,G418壓力篩選以確定有無輔助病毒存在。 5.含重組病毒顆粒的包裝細胞培養(yǎng)上清感染HepG2細胞,經(jīng)G418篩選穩(wěn)定細胞株,挑取穩(wěn)定細胞克隆并擴大培養(yǎng),最終獲得經(jīng)單克隆分化成長起的細胞株。Abbott化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀檢測HepG2-YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達,熒光定量法檢測上清HBV DNA,免疫組化檢測細胞內(nèi)HBcAg的表達,鑒定上清中HBV復(fù)制及抗原表達情況,測序鑒定HBV耐藥變異情況。 研究結(jié)果 1.PCR-RFLP的方法鑒定rtM204V突變成功。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點兩端引物進行PCR及測序,證實定點突變成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞,ELISA方法檢測HBsAg及HBeAg的表達均陽性。 2.HindⅢ及SalⅠ雙酶切重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點兩端引物PCR檢測,兩種方法均證實正向插入耐藥HBV基因及反向插入耐藥HBV基因兩種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞并經(jīng)過2周G418壓力篩選,得到產(chǎn)病毒包裝細胞多株。選取正向和反向插入目的基因兩實驗組細胞各一株行病毒滴度滴定。G418篩選10天后,10~6倍濃度稀釋上清所感染的培養(yǎng)孔則均無細胞生長,而此濃度下感染的培養(yǎng)孔內(nèi)則有細胞克隆存在,考慮病毒滴度均約在1×10~5CFU/ml。經(jīng)檢測無輔助病毒存在。 4.含反向插入1.3拷貝HBV基因的重組病毒上清感染HepG2細胞并行G418篩選,獲得的穩(wěn)定細胞株常規(guī)ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg均為陰性。 5.含正向插入1.3拷貝耐藥HBV基因的病毒上清感染HepG2細胞,共篩選出7株HBsAg及HBeAg均表達陽性的細胞克隆。挑取其中表達較高一株繼續(xù)培養(yǎng)并行進一步鑒定,命名為HepG2-YVDDHBV。同時在未突變野生株HBV病毒實驗對照組篩選出一株命名為HepG2-WHBV。 6.檢測HepG2-YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達及HBV DNA定量,2.2.15細胞株及未突變野生株HepG2-WHBV作為對照。結(jié)果均為陽性,但HepG2-sYVDDHBV的HBsAg、HBeAg表達及HBV DNA復(fù)制與2.2.15細胞株相比均明顯低。持續(xù)培養(yǎng)8周HepG2-YVDDHBV細胞株培養(yǎng)上清的HBsAg、HBeAg均有持續(xù)表達。 7.免疫組化檢測細胞內(nèi)HBcAg的表達,結(jié)果顯示HepG2-YVDDHBV細胞內(nèi)HBcAg陽性。 研究結(jié)論 成功構(gòu)建了含rtM204V/rtL180M位點突變的1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。成功將重組載體轉(zhuǎn)染PT67包裝細胞,獲得感染性重組病毒顆粒。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的方法,建立了含rtM204V/rtL180M變異HBV基因的穩(wěn)定細胞株HepG2-YVDDHBV。經(jīng)檢測其HBsAg及HBeAg的表達均陽性,免疫組化可檢測到細胞內(nèi)HBcAg的表達,熒光定量法檢測上清中HBVDNA為陽性。培養(yǎng)時間超過8周,HBsAg及HBeAg、HBV DNA持續(xù)陽性。測序結(jié)果顯示上清中HBV存在rtM204V及rtL180M變異,初步認為該細胞株支持拉米夫定耐藥HBV復(fù)制及表達,但其表達復(fù)制水平較低,距實用階段尚有差距。
【圖文】：

2.1YMDD突變位點鑒定使用我科設(shè)計的PCR一盯LP的方法t’”l，，行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)入幾搶I內(nèi)切酶酶切后電泳，野生株HBV及YVDD變異株HBV分別作為陰性與陽性對照。圖1一3顯示重組載體及 YVDDHBVPCR產(chǎn)物未能被從距I內(nèi)切酶消化，即為突變成功。19

pCR一尺Fll)檢測丫MOO關(guān)變Figurel一3YMDDmutationdeteetedbyPCR一RFLP
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 孫劍,侯金林,肖蕾,王戰(zhàn)會,章廉,馮筱榕,駱抗先;PCR-RFLP結(jié)合克隆測序監(jiān)測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變株的產(chǎn)生[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2001年06期

本文編號：2696618