【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一類排除了飲酒和其他明確的肝損因素,臨床病理特征主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)蓄積過量脂肪的綜合癥。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,主要認(rèn)為與氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和遺傳易感性有關(guān),常常伴隨有肥胖、糖尿病、高脂血癥、心血管疾病等代謝相關(guān)疾病。對(duì)氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)作為對(duì)氧磷酶家族成員之一,在脂類代謝中的抗氧化酶活性不容小覷,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。眾多研究表明,PON1在肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)中扮演重要角色,與健康人相比,NAFLD、肝纖維化和肝硬化患者的血清PON1活性均明顯下降,但PON1的基因和蛋白表達(dá)在NAFLD中的變化研究較少,以及何種原因造成這種改變尚不明確。目的:(1)應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選出可能靶向PON1的micro RNAs(miRNAs);(2)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNAs對(duì)PON1的調(diào)控作用;(3)探討健康人和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)患者血清中PON1和miRNA的水平變化,以期為NASH患者的診斷和治療提供新思路和新方法。方法:(1)采用Target Scan7.0軟件預(yù)測可能與PON1相關(guān)的miRNAs;隨后構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體,重組體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,報(bào)告熒光為h Rluc,校正熒光為h Luc,以h Luc熒光值與h Rluc熒光值比值表示被檢測的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測得的熒光素酶的相對(duì)活性,初步確定靶向PON1的相關(guān)miRNAs。(2)在Hep G2細(xì)胞中上/下調(diào)miRNA水平,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)具體分組如下:正常細(xì)胞對(duì)照組、模擬物及抑制劑陰性對(duì)照組、miRNA模擬物組及其抑制劑組、熒光無關(guān)對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測各組miRNA的表達(dá)情況,并采用蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)檢測Hep G2細(xì)胞中PON1蛋白的表達(dá)水平,以驗(yàn)證靶向PON1的miRNA。(3)收集34例NASH患者血清標(biāo)本,并以同期體檢健康者31例作為正常對(duì)照組,利用q RT-PCR技術(shù)檢測前期篩選出來的miRNA在兩組血清中的變化,同時(shí)采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測兩組中PON1的蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)采用Target Scan7.0軟件預(yù)測到了3種PON1相關(guān)的miRNAs:miR140-5p、miR183-5p和miR203a-3p。雙熒光素酶活性分析顯示,hsa-miR140-5p、hsa-miR183-5p和hsa-miR203a-3p模擬物對(duì)PON1野生型載體的報(bào)告熒光均具有明顯的下調(diào)作用(P miR140-5p0.001,P miR183-5p0.01,P miR203a-3p0.01)。(2)體外實(shí)驗(yàn)的q RT-PCR結(jié)果表明,與模擬物陰性對(duì)照組相比,miR140-5p在模擬物組有更高的表達(dá)水平(P0.001),而與正常細(xì)胞對(duì)照組相比,miR140-5p表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與抑制劑陰性對(duì)照組相比,miR140-5p在抑制劑組表達(dá)明顯降低(P0.05),而與正常細(xì)胞對(duì)照組相比,miR140-5p表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。WB結(jié)果表明,與模擬物陰性對(duì)照組相比,PON1蛋白的表達(dá)在miR140-5p模擬物組明顯下調(diào)(P0.001),與正常細(xì)胞對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);而抑制劑組則結(jié)果相反,與抑制劑陰性對(duì)照組相比,PON1蛋白的表達(dá)在miR140-5p抑制劑組明顯上調(diào)(P0.01),在與正常細(xì)胞對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)臨床NASH患者的研究顯示,與健康人對(duì)照組相比,NASH患者組血清中miR140-5p的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.01),而其血清PON1蛋白水平明顯升高(P0.05)。miR140-5p的AUCROC為0.719(95%CI:0.593~0.845),當(dāng)cut-off值為0.434時(shí),其作為NASH的篩查指標(biāo)的特異性為85.3%,敏感性為58.12%。結(jié)論:miR140-5p作為PON1的上游調(diào)控因子,能夠抑制PON1的表達(dá)。在NASH患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn),miR140-5p的表達(dá)水平降低,而PON1蛋白表達(dá)升高,提示miR140-5p可能通過對(duì)PON1的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,參與NASH的進(jìn)展,并有望成為NASH的診斷標(biāo)志物。
【圖文】：

typeof3’-UTR(bottom) and miRNA(top)7mer-A153-59 5' ...AΜΜAΜΜΜCAACCGC||| ||||||3' ΜCACΜΜAAGAΜGGΜ7mer-m87mer-m839~451582-15885' ...CAΜAAΜGAAΜAAA|||||||3' GAΜGGΜAΜCCCA5' ...ΜΜGΜΜΜGGGΜCAA|||||||3' GAΜGGΜAΜCCCA報(bào)告基因載體酶切鑒定和載體下游引物擴(kuò)增的條帶理論大小為 1200bp 左。見圖 1。

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 報(bào) 告 熒 光 有 明 顯 的 下 調(diào) 作 用 (t=10.50,P<0.001) ，， hsa-miR-18iR-203a-3p 對(duì) PON1 野 生 型 載 體 的 報(bào) 告 熒 光 有 一 定 的 下 調(diào)83-5p=0.0014，PmiR-203a-3p=0.003),各組數(shù)據(jù)比較 P 值均小于 0.01。見圖
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉麗雅;洪振豐;;表觀遺傳學(xué)與非酒精性脂肪肝病的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2014年04期

本文編號(hào)：2696267