【摘要】：具有逆轉錄特征的生物酶廣泛存在于乙型肝炎病毒(HBV)、人類T淋巴細胞病毒(HTLV)、鼠乳腺癌病毒(MMTV)、人類自身免疫缺陷病毒(HIV)、花椰菜花葉病毒(CaMV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等多種動植物病毒中，它們對人類的自身健康和生產(chǎn)生活產(chǎn)生了巨大的不良影響。針對逆向轉錄酶 (RT)的藥物研究具有廣泛的重要意義。通常情況下，藥物研發(fā)過程必須要設計出適合于高通量篩選的靶位模型。傳統(tǒng)的RT活性的~3H摻入檢測法由于其操作過程復雜和放射性核素使用方面固有的缺陷，已不能滿足當前的需要，而且難以發(fā)展成為高通量或半高通量的篩選技術。 我們在國內(nèi)首次構建了RT活性的ELISA檢測法，應用預先包被于Covalink 96孔板的poly(A)模板和不同來源的RT將生物素標記的dUTP摻入，用辣根過氧化物酶反應系統(tǒng)檢測酶活性，在一定時間范圍內(nèi)，反映酶活性的OD值的大小與時間呈線性關系。通過與放射性核素摻入檢測法進行比較，顯示兩種方法有明顯的一致性(HIV-1 RT：r~2=0.997)。應用ELISA法檢測奈韋拉平(NVP)、膦甲酸鈉(PFA)對HIV-1 RT活性的抑制作用，顯示出藥物作用的劑量依賴性，測得IC_(50)分別為0.23±0.12μg／ml、0.21±0.08μg／ml。同時，對ELISA法的重復性、穩(wěn)定性及用于抑制劑研究的特異性和敏感性進行了評價，證明了應用ELISA法檢測HIV-1 RT的活性具有簡便、快速、重復性好、特異性強的特點，適用于抗HIV-1 RT藥物的大樣品量篩選工作，，并可發(fā)展成為高通量技術。在成功構建HIV-1 RT ELISA檢測方法的基礎上，利用該方法，進一步檢測了莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(M-MLV-RT)、禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMV-RT)及鴨乙型肝炎復制復合體(DHBV RCs)的活性，同時還檢測了HIV-1感染細胞上清中RT的活性，證明ELISA法適用于具有逆轉錄特征的多種病毒酶的體外活性檢測。 隨著高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)在艾滋病患者中的廣泛應用，抗HIV感染的聯(lián)合化療取得了極大成功，HIV的傳播得到了一定程度的控制，最新的研究表明，僅僅聯(lián)合使用兩個RT抑制劑如齊多夫定(AZT)和奈韋拉平(NVP)亦可使患者血液中HIV滴度降至檢測不到的水平。然而，HBV感染的治療卻面臨著相當?shù)睦Ь常?) 與抗HIV RT的藥物相比，可供選擇抗HBV RT的治療藥物十分有限；2) 伴隨某種藥物的長期單一應用，耐藥病毒株不斷出現(xiàn)。尋找新的不同機制的抗HBV藥物，增加聯(lián)合用藥的候
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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本文編號：2694587