【摘要】： 【背景及目的】 急性肝衰竭死亡率高，治愈率低。其主要病理變化是肝細(xì)胞的大量死亡，從而導(dǎo)致肝功能?chē)?yán)重受損。其臨床特點(diǎn)是肝功能迅速惡化，可引起肝性腦病及凝血功能障礙。急性肝衰竭病因復(fù)雜，在我國(guó)由于病毒性肝炎感染率高，是引起肝衰竭的主要病因，其次可由藥物、植物或化學(xué)品中毒等引起。研究顯示，細(xì)胞凋亡在急性肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用。然而，迄今對(duì)于急性肝衰竭肝細(xì)胞發(fā)生大量凋亡的機(jī)理尚缺乏足夠認(rèn)識(shí)。一般而言細(xì)胞凋亡的發(fā)生存在二種機(jī)制：由攜帶凋亡信號(hào)的配體與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，將凋亡信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而啟動(dòng)一系列的生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，該途徑即死亡受體途徑；或由細(xì)胞核內(nèi)DNA的損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在急性肝衰竭早期是否存在DNA損傷及DNA損傷與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為了探討其發(fā)病機(jī)理，，本研究利用D-氨基半乳糖加脂多糖建立的小鼠動(dòng)物模型，以彗星實(shí)驗(yàn)、ELLISA、TUNEL等方法探討肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，包括： 1、研究急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA損傷的發(fā)生及演變。 2、研究急性肝衰竭模型小鼠血清TNF-α濃度的變化及與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 3、研究急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞損傷的演變過(guò)程。 4、研究天晴甘平干預(yù)對(duì)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制。 5、研究阿拓莫蘭干預(yù)對(duì)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞損傷及凋亡的影響及其機(jī)制。 【方法】 1、腹腔注射D-氨基半乳糖(D—galn)和脂多糖(LPS)，制作急性肝衰竭小鼠模型。 2、、采用彗星實(shí)驗(yàn)從早期開(kāi)始檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA的損傷，用Olive尾矩值表示DNA的損傷程度。 3、采用ELISA法檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠血清TNF-α的濃度。 4、采用HE染色的方法檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠肝組織的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 5、采用TUNEL法檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞的凋亡，并計(jì)算凋亡指數(shù)。 6、腹腔注射D-氨基半乳糖(D—galn)和脂多糖(LPS)前3h，實(shí)驗(yàn)組給予天晴甘平灌胃，分別于注射后不同時(shí)間點(diǎn)用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞核DNA的損傷。 7、腹腔注射D-氨基半乳糖(D—galn)和脂多糖(LPS)前2h，實(shí)驗(yàn)組給予肌肉注射阿拓模蘭，分別于注射D—galn和LPS后不同時(shí)間點(diǎn)用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞核DNA的損傷，用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α濃度，用TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。 【結(jié)果】 1、腹腔注射D-Galn和LPS后0.5h，模型組小鼠肝細(xì)胞核DNA的Olive尾矩值即明顯增大，至1 h，出現(xiàn)細(xì)胞核DNA損傷的肝細(xì)胞達(dá)100％，且隨時(shí)間延伸，肝細(xì)胞核DNA的Olive尾矩值逐漸增加。各組兩兩之間比較，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2、腹腔注射D-Galn和LPS后0.5 h，模型組小鼠血清TNF-α濃度無(wú)升高；1h略有升高，但與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2h以后，升高趨勢(shì)明顯，各組與正常對(duì)照組比較，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3、腹腔注射D-Galn和LPS 2h，模型組小鼠HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞始出現(xiàn)嗜酸性染色增強(qiáng)，至8h肝細(xì)胞出現(xiàn)大片壞死，肝竇明顯擴(kuò)張充血并出血。 4、腹腔注射D-Galn和LPS后6 h，模型組小鼠TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝組織始有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，至8 h出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。 5、腹腔注射D-Galn和LPS后，天晴甘平治療組與對(duì)照組比較Olive尾矩值明顯變小，差異具顯著意義(P＜0.05)。 6、腹腔注射D-Galn和LPS后，阿拓模蘭治療組與對(duì)照組比較Olive尾矩值明顯變小，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)；但血清TNF-α濃度無(wú)明顯改變；在腹腔注射D-Galn和LPS后的6h時(shí)間點(diǎn)，阿拓模蘭治療組的凋亡指數(shù)較對(duì)照組減少，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在8h時(shí)間點(diǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)論】 1、急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA較早出現(xiàn)損傷，并隨時(shí)間延伸逐漸加重，最終可能誘發(fā)了肝細(xì)胞凋亡。導(dǎo)致急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA損傷的原因可能是D-氨基半乳糖和脂多糖的毒性作用。同時(shí)，本研究HE染色的結(jié)果也提示，急性肝衰竭肝細(xì)胞壞死的機(jī)理部分也可能與肝細(xì)胞核DNA的損傷有關(guān)。 2、血清TNF-α濃度的升高與肝細(xì)胞核DNA損傷的發(fā)生及演變不完全同步，但可能具有進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞核DNA損傷的作用。 3、天晴甘平具有減輕急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞核DNA的損傷的作用。 4、阿拓模蘭具有減輕急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞核DNA的損傷及細(xì)胞凋亡的作用，但這種作用與血清TNF-α濃度的改變無(wú)關(guān)。
【圖文】：

2、肝細(xì)胞核DNA損傷檢測(cè)結(jié)果:未受損的細(xì)胞核表現(xiàn)為一圓形熒光核心，即彗星頭部，沒(méi)有拖尾;而受損的細(xì)胞核則有彗尾從核中伸向陽(yáng)極，形成一個(gè)亮的熒光頭部和尾部，見(jiàn)圖1一7。Olive尾矩值檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，腹腔注射D一Galn和 LPS0.5h肝細(xì)l7

注藥lh組，慧星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，x40o
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R575.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 張?jiān)?;阿拓莫蘭聯(lián)合促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療重癥肝炎及慢性肝炎重度的體會(huì)[J];重慶醫(yī)學(xué);2007年14期

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本文編號(hào)：2672490