【摘要】：【背景與目的】慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是一種進(jìn)行性的慢性炎癥疾病,胰腺外分泌實(shí)質(zhì)常常被破壞,并由纖維組織所取代,主要表現(xiàn)為餐后腹痛,痛點(diǎn)常常位于上腹部,可向背部放射,惡心和嘔吐是常見(jiàn)的伴隨癥狀。腹痛是CP中最顯著的癥狀和主要的臨床挑戰(zhàn),是高達(dá)90%的患者住院的主要原因,也是臨床醫(yī)師治療CP時(shí)面對(duì)的巨大難題。盡管人們對(duì)CP導(dǎo)致腹痛的研究經(jīng)歷了一個(gè)從胰腺解剖學(xué)機(jī)制到神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的轉(zhuǎn)變,但尚未完全揭示CP時(shí)內(nèi)臟痛覺(jué)信息的上傳途徑及其在高級(jí)中樞部位的調(diào)控機(jī)制。胰腺感覺(jué)傳入纖維一部分經(jīng)雙側(cè)T4~L4節(jié)段的脊神經(jīng)上傳,一般進(jìn)入脊髓背角換元以后,經(jīng)由脊髓丘腦束將感覺(jué)信息向上傳入高級(jí)中樞,如島葉和軀體感覺(jué)中樞,這一傳入途徑已被人們所熟知;另一部分傳入纖維經(jīng)雙側(cè)迷走神經(jīng)上傳,投射入腦干孤束核(nucleus tractus solitarii,NTS),NTS投射纖維向上多經(jīng)臂旁核傳遞到與情感有關(guān)的邊緣系統(tǒng)和高級(jí)認(rèn)知中心。NTS作為重要的內(nèi)臟感覺(jué)上傳的中繼核,與痛相關(guān)皮層之間如何聯(lián)系及其功能調(diào)節(jié),目前尚無(wú)足夠證據(jù)。近年來(lái)對(duì)前扣帶回(anterior cingular cortex,ACC)在認(rèn)知、情緒和疼痛等方面受到越來(lái)越多的關(guān)注。有研究在CP疼痛患者和動(dòng)物模型的腦電圖和功能磁共振中觀察到ACC的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重組現(xiàn)象,此外CP疼痛患者切除胰腺后仍殘留疼痛,提示ACC的中樞敏化在CP引起的內(nèi)臟痛的維持中起著關(guān)鍵的作用。然而CP疼痛信息經(jīng)NTS如何上傳至ACC,它們是否存在直接或間接的纖維聯(lián)系,ACC如何參與調(diào)節(jié)CP內(nèi)臟痛敏的機(jī)制,這些仍然不清。因此,本研究旨在建立三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘發(fā)的CP大鼠內(nèi)臟疼痛模型,利用神經(jīng)束路追蹤法、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、電生理學(xué)和行為學(xué)等方法,觀察NTS向ACC的直接上行投射,檢測(cè)ACC內(nèi)的錐體神經(jīng)元及其突觸傳遞和谷氨酸受體在CP內(nèi)臟疼痛狀態(tài)下形態(tài)與功能發(fā)生的可塑性改變;同時(shí)結(jié)合藥理學(xué)、光遺傳學(xué)與化學(xué)遺傳學(xué)等方法進(jìn)行干預(yù),探討ACC在CP內(nèi)臟痛敏的發(fā)生機(jī)制中的作用�！痉椒ā�(1)經(jīng)SD大鼠的胰膽管注射三硝基苯磺酸(TNBS)建立CP模型;利用HE染色觀察胰腺的病理變化;(2)應(yīng)用von Frey纖維絲、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),進(jìn)行大鼠行為學(xué)觀察,測(cè)定行為學(xué)變化的時(shí)相性;(3)將順標(biāo)示蹤病毒rAAV-CaMKIIα-EYFR-WPRE-pA注入NTS,觀察NTS向高級(jí)中樞的上行投射纖維聯(lián)系;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CP術(shù)后NTS與ACC內(nèi)痛相關(guān)核蛋白FOS的表達(dá);(4)應(yīng)用Med64多位點(diǎn)場(chǎng)電位方法誘發(fā)和記錄ACC內(nèi)多位點(diǎn)動(dòng)作電位的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)現(xiàn)象及其變化;應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄ACC V層錐體神經(jīng)元誘發(fā)的自發(fā)性興奮性突觸后電流(Spontaneous excitatory post synaptic currents,s EPSCs)和雙脈沖比值(paired pulse ratio,PPR);(5)利用免疫組化熒光雙重標(biāo)染色和Western blot方法分別觀察CP術(shù)后2周ACC內(nèi)囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Vesicular glutamate transporter 1,VGluT1)的表達(dá);運(yùn)用Western blot方法分別檢測(cè)膜蛋白與漿蛋白中谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞型NR2B及磷酸化水平和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體亞型GluR1的表達(dá)及磷酸化水平的變化;免疫電鏡技術(shù)觀察GluR1的分布及其與突觸后活性區(qū)的距離關(guān)系;(6)使用海人藻酸(Kainic acid,KA)損毀大鼠雙側(cè)ACC,檢測(cè)機(jī)械性刺激引起的內(nèi)臟痛反應(yīng)及其變化;利用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn),在雙側(cè)ACC置管,1周后建立CP模型,3周后雙側(cè)微量注射NMDA受體拮抗劑DL-2-氨基-磷酸戊酸(DL-AP5)和AMPA受體拮抗劑6-氰基-7-硝基-喹喔啉-2,3-二酮(CNQX),1h后檢測(cè)機(jī)械性刺激引起的內(nèi)臟痛行為及其改變;(7)利用光遺傳學(xué)方法,將rAAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry病毒注入CP組與sham組大鼠雙側(cè)ACC,1周后在ACC上方置光纖并建立CP模型,3周后在藍(lán)光照射下觀察機(jī)械性刺激引起的內(nèi)臟痛反應(yīng)和對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察,檢測(cè)CP模型動(dòng)物行為表現(xiàn)的改變;(8)利用化學(xué)遺傳學(xué)方法,將病毒rAAV-CaMKIIα-hM4Di-mCherry注入CP組與sham組大鼠雙側(cè)ACC,3周后腹腔給予CNO,1h后觀察機(jī)械性刺激引起的內(nèi)臟痛反應(yīng)和對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察,檢測(cè)CP模型動(dòng)物行為表現(xiàn)及其變化�！窘Y(jié)果】(1)大鼠CP模型的制作及胰腺的形態(tài)學(xué)變化TNBS誘發(fā)的CP模型大鼠與sham大鼠相比體重增加緩慢,胰腺出現(xiàn)小葉腺泡數(shù)減少、萎縮,小葉間纖維間隔變厚、并伴有水腫,及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。(2)CP大鼠的內(nèi)臟痛行為學(xué)表現(xiàn)和對(duì)其高級(jí)腦功能活動(dòng)的影響在術(shù)后7~28d,CP大鼠縮腹反應(yīng)閾值(abdominal withdraw threshold,AWT)下降;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總活動(dòng)路程與中央活動(dòng)路程百分比均降低;高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CP大鼠總穿梭次數(shù)與開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比均顯著下降;在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中,CP大鼠不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng);轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比掉落潛伏期沒(méi)有顯著性差異。(3)NTS向ACC發(fā)出直接上行投射及其參與CP內(nèi)臟痛信息傳遞的形態(tài)學(xué)證明將病毒注射入NTS內(nèi)3-4周后直接灌注切片,結(jié)果顯示在ACC內(nèi)可以見(jiàn)到病毒順標(biāo)的纖維和終末;在制成CP模型的不同時(shí)間點(diǎn),CP大鼠的NTS和ACC內(nèi)均可見(jiàn)到表達(dá)FOS蛋白的神經(jīng)元;隨著CP模型動(dòng)物存活時(shí)程的延長(zhǎng),FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量顯著增多,且ACC的II-III層與V-VI層之間的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量具有顯著性差異;NTS和ACC內(nèi)FOS神經(jīng)元的數(shù)量變化具有一致性,兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系。(4)CP內(nèi)臟痛敏大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元突觸傳遞的可塑性變化Med64多通道場(chǎng)電位記錄結(jié)果顯示CP大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元的放電幅值明顯減少,且產(chǎn)生LTP的通道數(shù)量和分布均減少。全細(xì)胞膜片鉗記錄CP大鼠ACC內(nèi)V層錐體神經(jīng)元,其s EPSCs的頻率和幅值增加,且CP大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元的PPF幅值減少;電刺激誘發(fā)的AMPA受體和NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流增強(qiáng);在電流鉗模式下觀察到了CP大鼠ACC錐體神經(jīng)元放電數(shù)目增加,引起動(dòng)作電位的最小電流減少。(5)CP內(nèi)臟痛敏大鼠ACC內(nèi)谷氨酸含量及其受體表達(dá)和分布的可塑性變化免疫組化和Western blot結(jié)果證實(shí)CP大鼠ACC內(nèi)VGlu T1表達(dá)上調(diào);Western blot檢測(cè)分離膜蛋白和漿蛋白的結(jié)果表明CP大鼠膜蛋白內(nèi)GluR1、pGluR1、NR2B和p NR2B上調(diào),而漿蛋白內(nèi)GluR1、pGluR1和p NR2B表達(dá)不變,NR2B減少。免疫電鏡結(jié)果表明大鼠ACC內(nèi)的GluR1陽(yáng)性標(biāo)記顆粒主要位于突觸后;CP大鼠ACC內(nèi)可見(jiàn)GluR1陽(yáng)性標(biāo)記顆粒至突觸后膜的距離減少,提示它們有向突觸活性區(qū)移的傾向。(6)CP內(nèi)臟痛敏大鼠雙側(cè)ACC損毀或給予谷氨酸受體拮抗劑對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟痛行為和高級(jí)腦功能的影響雙側(cè)損毀ACC可以顯著的提高CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中損毀ACC的CP大鼠與對(duì)照CP大鼠相比,總活動(dòng)路程和中央活動(dòng)路程百分比顯著升高;雙側(cè)ACC給予AMAP受體拮抗劑DL-AP5和NMDA受體的拮抗劑CNQX,均可以顯著升高CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值,在曠場(chǎng)中,中央活動(dòng)路程百分比顯著升高。(7)用光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)方法分別激活和抑制CP內(nèi)臟痛敏大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元的活動(dòng)對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟痛行為和高級(jí)腦功能的影響光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,藍(lán)光刺激激活A(yù)CC內(nèi)錐體神經(jīng)元不會(huì)影響CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值,在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,CP大鼠的總活動(dòng)路程和中央活動(dòng)路程百分比在刺激中與刺激前后對(duì)比也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,腹腔給予CNO抑制ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元,可以提高CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值和在曠場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)減少的情況,但對(duì)正常大鼠無(wú)影響。【結(jié)論】(1)NTS至ACC存在直接的上行投射纖維聯(lián)系;TNBS胰膽管內(nèi)注射誘發(fā)CP引起的內(nèi)臟痛行為改變;NTS與ACC神經(jīng)元內(nèi)FOS表達(dá)量增加,且有時(shí)相性;CP內(nèi)臟痛大鼠運(yùn)動(dòng)減少與焦慮抑郁樣負(fù)性情緒有關(guān);(2)CP內(nèi)臟痛狀態(tài)下,ACC內(nèi)興奮性突觸傳遞增強(qiáng),發(fā)生可塑性改變,其發(fā)生與谷氨酸的釋放及其受體表達(dá)變化有關(guān);(3)在CP內(nèi)臟痛狀態(tài)下,興奮ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元不能加重CP大鼠的內(nèi)臟痛與負(fù)性情緒;而抑制ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元興奮性可以有效緩解CP大鼠的內(nèi)臟痛和負(fù)性情緒。上述結(jié)果提示ACC可能是CP引起內(nèi)臟痛的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

與 sham 組（圖 1-1 B）相比 TNBS 組動(dòng)物（圖1-1 C）胰腺明顯萎縮，可見(jiàn)胰膽管擴(kuò)張且有膽汁淤積。此外，建模后，與sham 組和 na ve 組相比，TNBS 組大鼠的體重增長(zhǎng)緩慢（圖 1-1 D）。圖 1-1 胰膽管內(nèi) TNBS 注射建立慢性胰腺炎痛模型Figure 1-1 CP was induced by intraductal administration of TNBS

observed and compared by gross anatomical observation. D: TNBS-treated rats had decreased body weightalong the course of CP compared to sham group, while rat with sham surgery exhibited transient weightloss from POD 3 to 7 which returned to baseline after POD 14. n= 7 for each group, two-way ANOVA,*P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001, TNBS vs na ve; #P<0.05, ##P<0.01, sham vs na ve.胰腺 HE 染色結(jié)果顯示，na ve 組（圖 1-2A）和 sham 組（圖 1-2 B）胰腺組織的形態(tài)正常，而 TNBS-14d（圖 1-2 C）與 sham 相比，胰腺小葉腺泡數(shù)減少、萎縮，小葉間纖維間隔變厚、出現(xiàn)水腫，此外胰腺小葉內(nèi)及小葉纖維間隔均見(jiàn)中等量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。TNBS-28d（圖 1-2 D）與 sham 相比，胰腺小葉腺泡進(jìn)一步萎縮，，小葉內(nèi)導(dǎo)管囊狀擴(kuò)張，小葉內(nèi)及小葉間可見(jiàn)較多透明變性的纖維組織，伴中等量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。以上結(jié)果表明在 TNBS誘發(fā) CP 時(shí)，胰腺的改變符合臨床慢性胰腺炎患者炎癥病變[29]。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R576

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫天愛(ài);翁志軍;譚琳鎣;劉慧榮;;內(nèi)臟痛與行為學(xué)改變的相關(guān)研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)藥指南;2015年29期

2 王威;張燕;呂恩基;高志雄;趙金茹;;針刺上巨虛穴對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏腸易激綜合征模型大鼠血清胃腸激素的影響[J];甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年02期

3 祁德波;李為民;;電針對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏大鼠延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核NMDA-R1受體表達(dá)的影響[J];上海針灸雜志;2011年07期

4 戚莉;易韜;張建斌;常小榮;楊玲;劉慧榮;豐曉溟;吳煥淦;;溫和灸對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏模型大鼠結(jié)腸CRFR2表達(dá)的影響[J];世界中醫(yī)藥;2016年12期

5 張曉燕;吳斌;楊燕珍;陳素清;林希;;幼鼠結(jié)腸降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)與內(nèi)臟痛敏的相關(guān)性[J];中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

6 易韜;戚莉;吳璐一;劉慧榮;高強(qiáng);董競(jìng)成;吳煥淦;;溫和灸對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏大鼠CRF-CRFR1信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年05期

7 吳勝開(kāi);趙強(qiáng);劉佳;易韜;戚莉;;艾灸對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏大鼠脊髓Fos蛋白和sigma-1受體表達(dá)的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2017年11期

8 祁德波;李為民;;電針對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏大鼠脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)的影響(英文)[J];中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào);2012年12期

9 高志雄;王威;呂恩基;趙金茹;;針刺上巨虛穴緩解慢性內(nèi)臟痛敏的作用及機(jī)理[J];山西大同大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年03期

10 焦海霞;劉慶;林春;陳瑜;陳愛(ài)琴;;脊髓5-HT_(2A)受體對(duì)大鼠慢性內(nèi)臟痛敏反應(yīng)及其電針治療的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2011年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 劉愛(ài)玲;符翠萍;鄒惟瑩;楊蓓;張大雷;陳婷;吳磊;鄒挺;高昕妍;陳日新;;寒暑氣候?qū)?nèi)臟痛敏及艾灸大腸俞治療內(nèi)臟痛敏的影響[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)消化內(nèi)分泌生殖代謝生理專業(yè)委員會(huì)2011年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2011年

2 符翠萍;劉愛(ài)玲;楊興霞;鄒惟瑩;楊蓓;張大雷;陳婷;吳磊;鄒挺;高昕妍;陳日新;;艾灸大腸俞對(duì)新生大鼠直結(jié)腸球囊擴(kuò)張所致內(nèi)臟痛敏的影響[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)消化內(nèi)分泌生殖代謝生理專業(yè)委員會(huì)2011年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2011年

3 高志雄;王威;;電針上巨虛對(duì)內(nèi)臟痛敏大鼠模型的影響[A];2011中國(guó)針灸學(xué)會(huì)年會(huì)論文集（摘要）[C];2011年

4 鄒惟瑩;楊蓓;符翠萍;劉愛(ài)玲;楊興霞;張大雷;陳婷;吳磊;鄒挺;高昕妍;陳日新;;艾灸大腸俞對(duì)內(nèi)臟痛敏大鼠骨髓細(xì)胞TRPV1表達(dá)的影響[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)消化內(nèi)分泌生殖代謝生理專業(yè)委員會(huì)2011年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2011年

5 易韜;戚莉;吳璐一;劉慧榮;高強(qiáng);董競(jìng)成;吳煥淦;;溫和灸對(duì)慢性內(nèi)臟痛敏大鼠CRF-CRFR1信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用[A];第五屆全國(guó)中醫(yī)藥博士生優(yōu)秀論文專輯[C];2014年

6 蘇軍凱;李兆申;高峻;曹海蓮;鄒多武;;雌二醇側(cè)腦室注射對(duì)大鼠內(nèi)臟痛敏感性的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（上冊(cè)）[C];2007年

7 凌萍;段麗敏;朱盛華;朱靈燕;曾興穎;鄒惟瑩;楊蓓;張大雷;吳磊;戴群;鄒挺;;艾灸大腸俞減輕大鼠內(nèi)臟痛敏和骨髓細(xì)胞HSP70和TRPV1表達(dá)變化[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第24屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2014年

8 陳婷;楊蓓;吳磊;張大雷;熊明娣;鄒惟瑩;鄒挺;高昕妍;陳日新;;乳鼠直結(jié)腸擴(kuò)張后在體骨髓干細(xì)胞自發(fā)分化表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因初探[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第九屆全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第五次會(huì)員代表大會(huì)論文摘要集[C];2011年

9 王威;呂恩基;張燕;趙金茹;;針刺對(duì)腸易激綜合征大鼠NO及NOS水平的影響[A];2011中國(guó)針灸學(xué)會(huì)年會(huì)論文集（摘要）[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 任丹;前扣帶回調(diào)控慢性胰腺炎大鼠內(nèi)臟痛敏行為的機(jī)理研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 崔可密;針刺緩解慢性內(nèi)臟痛敏的作用及其機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 祁德波;慢性內(nèi)臟痛敏及針刺緩解內(nèi)臟痛的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 王智君;針刺對(duì)腸易激綜合征及血壓調(diào)控作用的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 朱啟城;艾灸“大腸俞”對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X_7受體介導(dǎo)內(nèi)臟痛敏的作用研究[D];南昌大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2669547