發(fā)布時間：2020-04-25 07:25

【摘要】：研究背景肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)被認為是參與肝纖維化最關(guān)鍵的細胞。局部組織的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin-System,RAS)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,已證實Ang-(1-7)有拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的肝纖維化作用。新發(fā)現(xiàn)RAS的組分alamandine,其結(jié)構(gòu)與Ang-(1-7)相似,可通過受體MrgD對AngⅡ發(fā)揮負性調(diào)控作用。自噬(autophagy)為HSC活化供能,促進HSC向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化并分泌細胞外基質(zhì);活性氧(ROS)作為氧化應(yīng)激(oxidative stress)的主要產(chǎn)物,是目前公認的自噬誘導(dǎo)劑之一。因此,alamandine是否能通過調(diào)控氧化應(yīng)激和自噬,進而對肝纖維化產(chǎn)生影響,是本文研究的重點。目的本課題擬通過腹腔注射四氯化碳的方法構(gòu)建大鼠肝纖維化模型,予持續(xù)alamandine腹腔泵入治療,探討alamandine對大鼠肝纖維化的總體作用以及組織中氧化應(yīng)激和自噬的影響。通過進一步體外研究alamandine對大鼠原代HSC內(nèi)氧化應(yīng)激及自噬的影響,明確肝纖維化的可能機制,為臨床干預(yù)肝纖維化提供新的靶點和策略。方法1、SD 大鼠隨機分為 Vehile 組(oil 組)、cc14 組、ALA 組、ccl4+ALA 組、ccl4+3MA組、cc14+Rapa組;4周后取肝組織和血液標(biāo)本。對肝組織進行HE染色、Masson染色、羥脯氨酸測定、免疫組化、Western blot、H202檢測以及血液標(biāo)本ALT、AST檢測,評價各組氧化應(yīng)激、自噬和肝纖維化水平。2、原代 HSC 分為對照組、AngⅡ組、alamandine 組、AngⅡ+ alamandine組。qRT-PCR和Western blot檢測細胞內(nèi)RAS組分表達水平變化。3、探索alamandine對AngⅡ誘導(dǎo)的HSC活化和膠原生成的影響,Western blot檢測細胞內(nèi)COL1A、α-SMA和CTGF等膠原相關(guān)蛋白表達水平。用MrgD受體抑制劑D-Pro7-Ang-(1-7)、MrgD受體激動劑β-alanine以及MrgD siRNA抑制或者刺激MrgD受體后,檢測膠原相關(guān)蛋白表達水平。4、探索alamandine對AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響,Western blot檢測NOX4蛋白表達水平,酶標(biāo)儀檢測ROS含量,H202試劑盒檢測H2O2的含量,Transwell實驗檢測HSC的遷移情況。分別用NOX4 siRNA和MrgD siRNA轉(zhuǎn)染HSC后,Western blot檢測NOX4和膠原相關(guān)蛋白表達水平。5、探索AngⅡ和alamandine對HSC自噬的調(diào)控,Western blot檢測細胞內(nèi)自噬通路蛋白表達水平,透射電子顯微鏡(TEM)檢測細胞內(nèi)自噬體情況,mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染HSC后共聚焦顯微鏡觀察自噬流情況,LC3 siRNA和NOX4 siRNA轉(zhuǎn)染HSC后檢測自噬蛋白和膠原相關(guān)蛋白表達水平。結(jié)果1、與對照組(Vehile組)相比,ccl4組肝內(nèi)氧化應(yīng)激、自噬、肝纖維化指標(biāo)均顯著增高;與cc14組相比,ccl4+ALA組和ccl4+3MA組肝內(nèi)氧化應(yīng)激、自噬、肝纖維化指標(biāo)均明顯降低;與ccl4組大鼠相比,cc14+Rapa組肝內(nèi)氧化應(yīng)激、自噬、肝纖維化指標(biāo)均有增高。2、Ang Ⅱ刺激后,原代HSC內(nèi)ACE和AT1R的表達明顯升高,ACE2和MrgD的表達降低;alamandine刺激后,原代HSC內(nèi)ACE2和MrgD的表達明顯升高,ACE和AT1R的表達降低。3、Alamandine與Ang-(1-7)作用相似,均可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的原代HSC活化和膠原生成;而這一抑制作用被alamandine的受體MrgD阻斷劑D-Pro7-Ang-(1-7)解除,但不能被MAS受體阻斷劑A779解除。MrgD受體激動劑β-alanine亦能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC活化和膠原生成。MrgD受體被siRNA沉默后,alamandine以及β-alanine都不能抑制AngⅡ的誘導(dǎo)作用。4、Alamandine抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC內(nèi)ROS、H202生成和NOX4蛋白表達�？寡趸瘎㎞AC和NOX4抑制劑VAS2870亦可抑制Ang Ⅱ的誘導(dǎo)作用。干擾NOX4或者MrgD后,NOX4、COL1A、α-SMA和CTGF的蛋白表達水平顯著降低。5、透射電鏡、自噬流和Western blot結(jié)果均提示:AngⅡ刺激后HSC內(nèi)自噬水平明顯增加;alamandine可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC自噬激活,而這一抑制作用被D-Pro7-Ang-(1-7)解除。NAC和VAS2870亦可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的自噬水平升高。干擾LC3或者NOX4后,HSC內(nèi)自噬水平降低,HSC活化和膠原生成被抑制。結(jié)論1.外源性持續(xù)腹腔泵入alamandine能夠抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化,并能減輕肝組織氧化應(yīng)激和自噬水平。2.AngⅡ通過誘導(dǎo)由NOX4介導(dǎo)的ROS生成激活HSC自噬,促進HSC活化和膠原生成。3.Alamandine通過抑制NOX4介導(dǎo)的ROS生成調(diào)控HSC自噬,阻斷AngⅡ的誘導(dǎo)作用。4.結(jié)合已有文獻報道及本課題研究結(jié)果,我們推斷在alamandine影響肝纖維化的作用機制中,可能存在如下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如圖):
【圖文】：

結(jié)果輕。逡逑－１－１邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｐｉｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ，邋ｃｃｌ４，邋ＡＬＡ，邋ｃｃｌ４邋ｐｌｕｓ邋Ａ３ＭＡ邋ａｎｄ邋ｃｃｌ４邋ｐｌｕｓ邋Ｒａｐａ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｈ＆Ｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：邋ｘ２００）．邋Ｔｈｅｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｗａｓ邋ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ邋ｉｎ邋ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ＡＬＡ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．邋Ｔｈｅ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｌｏｂｕｌｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｗａｓ邋ｄａｍａｇｅｄ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４邋ｇＲａｐａ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，邋ｅｓｐｅｌ邋ａｒｅａ．邋Ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｅ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｌｏｂｕｌｅ邋ｗｅｓ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｅ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｌｉｇｈｔｅｎｅｄ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４＋ＡＬＡ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｃｃｌ４＋３ＭＡ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑Ｖｅｅ逡逑

ＩＨＳＡＫ邐Ｍｅｔａｖｉｒ逡逑圖１－１－２．各組肝組織肝纖維化丨ＳＨＡＫ評分和Ｍｅｔａｖｉｒ評分。結(jié)果提示：與Ｖｅｈｉｃｌｅ組和ＡＬＡ逡逑組相比，ｃｄ４組的肝纖維化評分明顯增高；而外源性持續(xù)腹腔泵入Ａｌａｍａｎｄｉｎｅ（ｃｄ４＋ＡＬＡ組）逡逑可減輕肝纖維化程度。予自噬誘導(dǎo)處理后，ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ組肝纖維化評分較ｃｃｌ４組增高；而予逡逑自噬抑制處理后，ｃｃｌ４＋３ＭＡ組肝纖維化評分較ｃｃｌ４組降低（＊提示與Ｖｅｈｉｃｌｅ組相比，Ｐ＜０．０５；逡逑＃提示與ｃｃｌ４組相比，，Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇ．ｌ－ｌ－２．Ｔｈｅ邋ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ＩＳＨＡＫ邋ａｎｄ邋Ｍｅｔａｖｉｒ邋ｓｃｏｒｅ．邋Ａｌｌ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｓｓａｙｓ逡逑ｗｅｒｅ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｉｎ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＥＭ．邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逡逑ｇｒｏｕｐ；＂邋ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｔｈｅ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ．逡逑１．２大鼠肝組織Ｍａｓｓｏｎ染色計算膠原面積逡逑ＳＤ邋大鼠隨機分為邋Ｖｅｈｉｌｅ邋組（ｏｉｌ邋組）、ｃｃｌ４邋組、ＡＬＡ邋組、ｃｃｌ４＋ＡＬＡ邋組、ｃｃｌ４＋３ＭＡ逡逑組、ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ組
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王燕;馬燕;吳琦琦;莊小芳;王曉波;王曉忠;;非酒精性脂肪性肝病進展性肝纖維化危險因素分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2019年01期

2 嚴何;;肝纖維化的機制及研究進展[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2019年16期

3 楊鐵戈;梁爽;周波;;中藥治療肝纖維化研究進展[J];中國民族民間醫(yī)藥;2019年08期

4 高洋;王娟;肖歡;朱麗容;徐娟;唐毅;;聲輻射力脈沖成像評價兒童肝纖維化的臨床應(yīng)用價值[J];臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志;2019年05期

5 王慧;許劍蘭;鄭成芳;陳靈芝;;miR-33a miR-133a對慢性乙肝感染患者肝纖維化評估作用[J];河北醫(yī)學(xué);2019年05期

6 徐列明;劉平;沈錫中;吳亞云;平鍵;;肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)[J];臨床肝膽病雜志;2019年07期

7 付洪彥;龔作炯;;肝纖維化的發(fā)生機制及其診療研究進展[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2018年02期

8 田志良;秦春宏;;肝纖維化的診斷研究進展[J];西南軍醫(yī);2018年03期

9 黎妍;羅偉生;;中醫(yī)藥防治肝纖維化的研究進展[J];大眾科技;2018年09期

10 徐列明;;肝纖維化,治療有術(shù)需重視[J];肝博士;2018年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 呂小燕;;肝纖維化的研究現(xiàn)狀[A];第二十九屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2017年

2 陳永平;;肝纖維化的研究進展[A];國家中醫(yī)藥管理局繼續(xù)教育項目2015年中西醫(yī)結(jié)合肝病研究進展學(xué)習(xí)班講義[C];2015年

3 賈繼東;;肝纖維化的發(fā)生機理研究進展[A];中華醫(yī)學(xué)會第三次全國肝纖維化、肝硬化學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

4 陸倫根;;非酒精性脂肪性肝病與肝纖維化[A];中華醫(yī)學(xué)會第三次全國肝纖維化、肝硬化學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

5 郭津生;;肝纖維化發(fā)生機制研究進展[A];中華醫(yī)學(xué)會第三次全國肝纖維化、肝硬化學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

6 陳永平;;肝纖維化的研究熱點[A];2015年杭嘉湖感染性疾病學(xué)術(shù)年會暨國家級繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育培訓(xùn)班大會報告集[C];2015年

7 趙廣強;張閩光;;肝纖維化動物模型制備的常用方法[A];全國第十三次中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)術(shù)研討會全國中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)研究進展學(xué)習(xí)班福建省第八次中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2014年

8 楊從意;陳英杰;程晶;李群;周大橋;;淺談肝纖維化的臨床研究進展[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會第十三屆內(nèi)科肝膽病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

9 楊麗;楊長青;郜恒俊;常義忠;王勝蘭;張照杰;;液態(tài)蛋白質(zhì)芯片檢測肝纖維化方法的建立[A];第九次全國消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議專題報告論文集[C];2009年

10 李浩;李俊;黃成;黃艷;程娟;李政通;章圣朋;陶輝;;實驗性大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中血清瘦素動態(tài)變化研究[A];轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 柯訊;中國科大發(fā)現(xiàn)治療肝纖維化智能療法[N];中國科學(xué)報;2018年

2 孟凡林;中科院：肝纖維化臨床智能診斷獲新突破[N];健康報;2018年

3 福建莆田 吳志;肝纖維化不可小覷(下)[N];上海中醫(yī)藥報;2018年

4 傅德明;柴胡與丹參配伍抗大鼠肝纖維化作用的實驗研究[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

5 吳楊 楊蘇河;減緩肝纖維化進程[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

6 第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院教授 謝渭芬　整理 王根華;阻斷肝纖維化發(fā)展的鏈條[N];健康報;2010年

7 黃丁毅;福瑞股份：肝纖維化�？泼鎸Α白龃蟆泵}[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

8 北京地壇醫(yī)院傳染科主任醫(yī)師 蔡皓東;肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的[N];保健時報;2010年

9 健康時報記者 劉橋斌;肝纖維化定期做FS檢查[N];健康時報;2009年

10 解放軍302醫(yī)院肝纖維化無創(chuàng)診療中心 陳國鳳 黃顯斌 整理;肝纖維化檢查進入無創(chuàng)時代[N];健康報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李洋;醛固酮通過小窩蛋白-1依賴途徑介導(dǎo)肝星狀細胞活化及肝纖維化形成的機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

2 熊鳴;慢性乙型肝炎患者肝纖維化的非傳統(tǒng)危險因素分析—基于瞬時彈性成像的一項前瞻性隊列研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

3 馮軼;新型苦參堿衍生物抑制肝星狀細胞活化及抗肝纖維化機制的實驗研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

4 王艷歌;蟲源microRNA在日本血吸蟲病肝纖維化中的功能及其機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

5 卞爾保;Hotair在肝纖維化中的作用及其相關(guān)機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

6 李國娟;COX-2shRNA通過誘導(dǎo)肝星狀細胞衰老改善肝纖維化的作用機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

7 張漢;ASPH促進肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用與機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

8 錢寶鑫;SND1延緩CCl_4誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝纖維化進程但促進肝癌的發(fā)生及發(fā)展[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

9 李雪萍;基于康復(fù)新液對肝纖維化模型大鼠的影響探究中醫(yī)肝絡(luò)病理論[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2018年

10 曹慧;當(dāng)歸六黃湯抗胰島素抵抗、脂肪肝和肝纖維化的作用及機制研究[D];華中科技大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 孫玉潔;直接抗病毒藥物抗丙肝病毒治療前后肝纖維程度變化研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2019年

2 左瑞靜;1,25(OH)2-D3通過干預(yù)Smurf2表達抑制大鼠肝纖維化[D];河北工程大學(xué);2019年

3 賀國娜;肝纖維化形成過程中肝組織Nrf2、NOX4mRNA及血清ROS的變化[D];山西醫(yī)科大學(xué);2019年

4 張曉穎;“風(fēng)藥”防風(fēng)對肝纖維化活血化瘀治療增效作用的實驗研究[D];蘭州大學(xué);2019年

5 潘曉華;Gd-EOB-DTPA增強MRI及T1 mapping評價肝纖維化分級臨床價值的對比研究[D];蘭州大學(xué);2019年

6 黃峗;Alamandine通過調(diào)控氧化應(yīng)激和自噬影響肝纖維化的作用及機制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

7 俞海霞;YAP在肝纖維化及其逆轉(zhuǎn)中功能和調(diào)控機制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

8 金猛猛;經(jīng)LV-mmp13轉(zhuǎn)染的巨噬細胞逆轉(zhuǎn)日本血吸蟲病肝纖維化的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

9 卜芳田;SENP2在小鼠肝纖維化進展期及逆轉(zhuǎn)期的功能與機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

10 陶奔;GUCI評分在慢性HBV感染者肝纖維化無創(chuàng)診斷中的臨床價值[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號：2639968