【摘要】：據(jù)統(tǒng)計(jì),高甘油三脂血癥性胰腺炎(hypertriglyceridemia pancreatitis,HTGP)近年來(lái)已成為我國(guó)急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的第三大病因,但其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia,HTG)時(shí)游離脂肪酸(free fatty acids,FFAs)對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的毒性作用和細(xì)胞鈣內(nèi)超載導(dǎo)致的腺泡細(xì)胞損傷是目前公認(rèn)的HTGP發(fā)病機(jī)制。但以上研究均聚焦于胰腺腺泡細(xì)胞。胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及其分泌物構(gòu)成了一特殊結(jié)構(gòu)-胰管黏膜屏障(pancreatic ductal mucosa barrier,PDMB)。同時(shí),胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞延伸至腺泡腔與腺泡細(xì)胞相鄰。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:在雨蛙肽腹腔注射誘導(dǎo)的HTGP大鼠AP模型胰腺組織中肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase,MLCK),L型鈣離子通道Cav1.2表達(dá)上調(diào)及緊密連接(tight junction,TJ)改變[1,2],結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道:高甘油三酯血癥大鼠模型中胰腺腺泡細(xì)胞無(wú)明顯脂肪變[3]。我們推測(cè)FFAs可能通過(guò)對(duì)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及其構(gòu)成的PDMB產(chǎn)生損傷而導(dǎo)致HTGP發(fā)病。而MLCK,Ca2+通道及TJ是否參與其中?本文將展開(kāi)初步研究。第一部分高脂環(huán)境對(duì)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞MLCK及細(xì)胞間緊密連接的影響目的:用油酸(oleic acid,OA)和軟脂酸(palmitic acid,PA)與HPDE6C7細(xì)胞共培養(yǎng),模擬體內(nèi)的高脂環(huán)境,觀察在高脂環(huán)境下HPDE6C7細(xì)胞中MLCK,TJ相關(guān)蛋白和Ca2+通道m(xù)RNA的表達(dá)水平變化。方法:分別用不同濃度的OA(100,200,300,400,500μM/L)和PA(100,200,300,400,500μM/L)處理HPDE6C7細(xì)胞24h。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖;q PCR法檢測(cè)MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1、Cav3.2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:1.(1)OA:在濃度為300μM,400μM和500μM時(shí)抑制HPDE6增殖,以500μM時(shí)抑制最明顯(P0.05)。(2)PA:在濃度為200μM,300μM,400μM和500μM時(shí)抑制HPDE6增殖,以500μM時(shí)抑制最明顯(P0.05)。2.(1)OA:在濃度為400μM增加MLCK mRNA表達(dá)(P0.05);濃度為300μM時(shí)抑制Occludin mRNA表達(dá)(P0.05);不同濃度OA均抑制ZO-1 mRNA表達(dá)(P0.05),且對(duì)Claudin-2 mRNA表達(dá)無(wú)影響(P0.05)。(2)PA:增加MLCK mRNA表達(dá),呈濃度依賴性(P0.05);PA在濃度為200μM時(shí)抑制Claudin-2和Occludin mRNA表達(dá)(P0.05);在濃度為100μM-300μM抑制ZO-1 mRNA表達(dá)(P0.05)。3.(1)OA:濃度在400μM和500μM時(shí)增加Cav2.2 mRNA表達(dá)(P0.05);OA濃度在300μM,400μM和500μM時(shí)增加Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1mRNA表達(dá)(P0.05);不同濃度OA對(duì)Cav3.2無(wú)影響(P0.05)。(2)PA:濃度在200μM和500μM增加Cav1.2和Cav2.1 mRNA表達(dá)(P0.05);PA濃度在300μM,400μM和500μM時(shí)增加Cav2.2和Cav3.2 mRNA表達(dá)(P0.05);PA濃度在200μM,300μM,400μM和500μM時(shí)增加Cav1.3和Cav3.1mRNA表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.OA和PA抑制人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6C7細(xì)胞增殖,以500μM時(shí)抑制作用最明顯。2.OA和PA上調(diào)HPDE6C7細(xì)胞中MLCK及Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1 mRNA表達(dá),減少ZO-1、Occludin和Claudin-2 mRNA表達(dá)。第二部分MLCK在雨蛙肽誘導(dǎo)的HTGP胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞模型中的表達(dá)變化目的:用雨蛙肽(caerulin,CAE)刺激與PA共培養(yǎng)的HPDE6C7細(xì)胞,模擬體內(nèi)HTGP的發(fā)病過(guò)程,結(jié)合ML-7干預(yù)。觀察上述條件對(duì)細(xì)胞中MLCK,TJ相關(guān)蛋白和Ca2+通道的影響。方法:用濃度為200μM的PA與HPDE6C7細(xì)胞共培養(yǎng)24h后加入CAE和ML-7預(yù)處理。用q PCR檢測(cè)MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3的mRNA表達(dá)水平。Western Blot法檢測(cè)MLCK、ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表達(dá)水平。FITC-Dextran法檢測(cè)單層HPDE6C7細(xì)胞通透性。直接免疫熒光法觀察細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1.與PA共培養(yǎng)時(shí):MLCK蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào),Cav1.2和Cav1.3mRNA表達(dá)上調(diào);ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表達(dá)減少,(P0.05);HPDE6C7細(xì)胞通透性增高,局部微絲排列紊亂。2.CAE刺激后:MLCK蛋白和mRNA表達(dá)繼續(xù)上調(diào),與PA組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin mRNA表達(dá)減少,與control組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與PA組比較,Claudin-2 mRNA表達(dá)減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Cav1.2和Cav1.3 mRNA上調(diào),但與PA組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表達(dá)表達(dá)下調(diào),與control組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)下調(diào),與PA組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。單層HPDE6C7細(xì)胞通透性增高,正常微絲結(jié)構(gòu)破壞,微絲解聚,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)坍塌。3.ML-7干預(yù)組:MLCK蛋白和mRNA表達(dá)減少,與PA+CAE組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Cav1.2和Cav1.3 mRNA表達(dá)與PA+CAE組兩兩比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào),其中ZO-1與Occludin蛋白和mRNA上調(diào)與PA+CAE組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HPDE6C7細(xì)胞通透性降低,微絲結(jié)構(gòu)排列紊亂,破壞程度較PA+CEA組輕。結(jié)論:1.CAE導(dǎo)致高脂環(huán)境下HPDE6C7細(xì)胞MLCK蛋白和mRNA表達(dá)增多,ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表達(dá)減少,微絲正常結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞通透性增高。2.MLCK抑制劑可改善CAE刺激后高脂環(huán)境下HPDE6C7細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)破壞,增加ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表達(dá),降低細(xì)胞通透性。3.PA和PA+CEA均能上調(diào)Cav1.2和Cav1.3 mRNA表達(dá),但兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ML-7對(duì)此無(wú)抑制作用。第三部分干擾MLCK基因?qū)TGP胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞通透性及緊密連接影響的初步研究目的:使用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),對(duì)人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6C7細(xì)胞的MLCK基因進(jìn)行mi RNA干擾,構(gòu)建帶EGFP報(bào)告基因的慢病毒載體;用構(gòu)建的MLCK-mi RNA載體轉(zhuǎn)染HPDE6C7細(xì)胞,形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,并與PA和CAE共培養(yǎng),觀察單層胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞通透性及TJ相關(guān)蛋白表達(dá)變化。方法:1.克隆人源MLCK基因,連接到經(jīng)Asc I和Pme I酶切后p Lenti6.3-EGFP載體上,構(gòu)建p Lenti6.3-EGFP-MLCK重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝慢病毒;用慢病毒感染人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6C7,殺瘟稻素(blasticidin,BSD)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,q PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。2.將篩選成功的MLCK-mir-HPDE6C7細(xì)胞與空載慢病毒的陰性對(duì)照組和正常HPDE6C7細(xì)胞與PA共培養(yǎng),CAE刺激后用Western Blot法檢測(cè)MLCK、ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表達(dá)水平。FITC-Dextran法檢測(cè)單層HPDE6C7細(xì)胞通透性。結(jié)果:1.經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建人源MLCK基因的mi RNA慢病毒干擾載體及重組質(zhì)粒;共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生的重組慢病毒顆粒感染HPDE6C7細(xì)胞后高表達(dá)綠色熒光;BSD篩選14天q PCR顯示mi RNA慢病毒轉(zhuǎn)染組MLCK mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降(P0.05);2.L+PA組和L+PA+CEA組中MLCK蛋白表達(dá)較其他組低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3.與control組相比,LNC+PA組和LNC+PA+CEA組中MLCK蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞通透性升高,Claudin-2、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.與LNC+PA+CEA組相比,L+PA組和(或)L+PA+CEA組中Claudin-2、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞通透性降低(P0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.成功建立穩(wěn)定干擾MLCK基因的HPDE6C7細(xì)胞系。2.干擾HPDE6C7細(xì)胞MLCK基因表達(dá)后,HTGP胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞模型通透性降低,TJ相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。
【圖文】：

（1）OA在濃度為100μM和200μM對(duì)HPDE6C7細(xì)胞無(wú)抑制增殖作用（P＞0.05）；在濃度為300μM，400μM和500μM時(shí)均可抑制HPDE6C7增殖，以500μM時(shí)抑制最明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖1-1A。（2）PA在濃度為100μM時(shí)對(duì)HPDE6C7細(xì)胞無(wú)抑制增殖作用（P＞0.05）；在濃度為200μM，300μM，400μM和500μM時(shí)均可抑制HPDE6C7增殖，，以500μM時(shí)抑制最明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖1-1B。圖1-1油酸和軟脂酸對(duì)HPDEC7細(xì)胞增殖的抑制A.不同濃度油酸對(duì)HPDEC7細(xì)胞增殖的抑制 B. 不同濃度軟脂酸對(duì)HPDEC7細(xì)胞增殖的抑制Fig 1-1 Inhibition effects of oleic acid and palmitic acid on HPDEC7A. Inhibition effects of different concentration of oleic acid；B.Inhibition effects of different concentrationof palmitic acid* vs control group P＜0.05真努力奮斗才能夢(mèng)想成真努力奮斗才能夢(mèng)想成真努力奮斗才能夢(mèng)想成真努力奮斗才能夢(mèng)想成真努力奮斗才能夢(mèng)想成真努力奮斗才能夢(mèng)想成真努力奮斗?

腺炎胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中作用的初步研究 博士學(xué)位論文34圖1-3 油酸和軟脂酸對(duì)Ca2+通道 mRNA表達(dá)影響A、C、E、G、I、K:油酸對(duì)Cav1.2、Cav1.3、Cav2.2、cav2.1、Cav3.1、Cav3.2 mRNA表達(dá)影響B(tài)、D、F、H、J、L:軟脂酸對(duì)Cav1.2、Cav1
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R576

【參考文獻(xiàn)】

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10 黃薇;陳楨s

本文編號(hào)：2639933