【摘要】： 背景 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是最嚴重和最普遍的健康問題之一,全世界約有20億人受累。盡管從1982年開始使用HBV疫苗后,HBV感染率大為下降,全世界至今仍有超過3.5億的慢性HBV攜帶者,其中約75%分布于亞太平洋地區(qū)。隨著感染時間延長,HBV感染者發(fā)生肝臟功能失代償、肝硬化、肝細胞癌的風(fēng)險亦逐漸增加,全世界每年約有50-120萬人死于HBV感染相關(guān)的終末期肝病。我國約有1.2億HBV感染者,其中2000-3000萬為慢性活動性肝病患者。因此,慢性HBV感染依然是一個具挑戰(zhàn)性的全球健康問題。 HBV感染的結(jié)局與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān),其中機體對HBV的免疫耐受而導(dǎo)致特異性細胞毒性T細胞(CTL)應(yīng)答不足是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要原因。慢性HBV感染的免疫學(xué)特點主要有:①存在不同程度的免疫耐受。HBV感染病例外周血中有大量病毒抗原,血液高濃度的病毒抗原長期刺激,可能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Treg細胞,PD-1及CTLA-4等免疫抑制分子表達上調(diào),從而使病毒特異性細胞免疫反應(yīng)低下或缺失。②抗原提呈細胞特別是樹突狀細胞(DC)數(shù)量較少或功能缺陷,影響DC-T細胞間的相互作用,致使HBV抗原特異性T細胞HLA-Ⅱ表達下降,導(dǎo)致T細胞應(yīng)答減弱、增殖不足,不能激活Th細胞產(chǎn)生細胞因子、或不能激活CTL的細胞毒活性;③HBV特異性TCR CDR3譜型較窄或峰形偏倚,T細胞呈單克隆性或寡克隆性增生,從而使機體對HBV抗原的識別及應(yīng)答譜較窄;④Ⅰ型及Ⅱ型輔助性T淋巴細胞(Helper T lymphocyte,Th)失平衡。在病毒復(fù)制部位T細胞分泌的細胞因子型可能影響感染的最后結(jié)局,特異性Th1細胞占優(yōu)勢時,可促進細胞免疫反應(yīng),有利于清除病毒;而Th2細胞占優(yōu)勢時,雖然有利于產(chǎn)生針對HBV的抗體,但容易使感染慢性化。慢性HBV感染者Th1型細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2等)相對不足,而Th2型細胞因子(IL-4、IL-10等)水平相對較高,因而維持慢性感染狀態(tài)。⑤抗病毒相關(guān)的細胞因子(TNF-α及IFN-γ等)可能存在基因突變、基因多態(tài)性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的異常。 隨著對乙型肝炎病毒學(xué)、免疫學(xué)及慢性感染自然史認識的提高,目前公認HBV復(fù)制是免疫介導(dǎo)肝損傷和疾病進展的關(guān)鍵驅(qū)動者。自1998年以來,一些有效的口服抗病毒藥物的批準使用使乙型肝炎的治療發(fā)生了革命性的變化。目前批準用于抗HBV治療的藥物分兩大類,注射用的干擾素(普通干擾素和長效干擾素)及口服的核苷(酸)類似物(拉米夫定、阿德福韋、替比夫定和恩替卡韋等)。這些藥物可有效的抑制病毒復(fù)制和阻止疾病進展,但卻不能完全清除病毒;核苷(酸)類似物長期治療的耐藥問題也是一個很大的缺陷。因此,我們需要尋找新的藥物或治療策略來提高慢性乙型肝炎治療的效果。 近年,醫(yī)用臭氧用于治療乙型病毒性肝炎成為一種新的探索。醫(yī)用臭氧是臭氧與醫(yī)用純氧的混合氣體,可用于治療風(fēng)濕、潰瘍性結(jié)腸炎、椎間盤突出癥等多種疾病。臭氧作用全血后產(chǎn)生活性氧(ROS,主要是H_2O_2)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(LOPs),這兩種產(chǎn)物分別作用于血液中的各種成分(單核細胞、血小板、紅細胞、白細胞)及內(nèi)皮細胞和其他器官,產(chǎn)生各種效應(yīng),近年來過氧化氫(H_2O_2)被認為是動、植物細胞中一個重要的細胞內(nèi)信使,因此臭氧是通過其反應(yīng)產(chǎn)物間接發(fā)揮作用。中國大陸在2004年底開始臭氧治療乙型病毒性肝炎的嘗試并且初見療效,醫(yī)用臭氧有望成為治療慢性乙型肝炎的一種新的策略。但其作用機制不清楚。既往研究推斷醫(yī)用臭氧具有免疫調(diào)節(jié)作用,但尚需進一步證實,因此,研究醫(yī)用臭氧的免疫作用機制具有重要的臨床意義。 目的 通過研究醫(yī)用臭氧體外對慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者外周血單個核細胞(PBMC)分泌細胞因子功能的影響, 1.探索臭氧治療CHB的細胞免疫學(xué)機理; 2.為醫(yī)用臭氧治療CHB提供基礎(chǔ)研究的證據(jù),促進并推廣其在臨床上的應(yīng)用; 3.為CHB的治療尋找新策略,提高治療效果。 方法 1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測臭氧作用后CHB患者PBMC培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平:分別采集11例CHB患者和8例健康獻血員外周血10ml,密度梯度離心法分離PBMC,用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸后,以不同濃度(4、10、20、40、80μg/mL)的醫(yī)用臭氧冒泡法作用后,于37℃含5%CO_2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時;設(shè)置醫(yī)用純氧(O_2,冒泡法作用)、陽性(PHA 10μg/ml刺激)、陰性(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基)及雙復(fù)孔自身對照組。培養(yǎng)結(jié)束后,ELISA檢測各處理組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-4的濃度,操作步驟按照試劑盒說明書進行。 2.流式細胞術(shù)(FCM)檢測臭氧作用后CHB患者CD4+和CD8+T細胞中IFN-γ和IL-4陽性細胞的比例:分別采集8例CHB患者和6例健康獻血員外周血10ml,密度梯度離心法分離PBMC,用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸后,以不同濃度(4、10、20、40、80μg/mL)的醫(yī)用臭氧冒泡法作用后,于37℃含5%CO_2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時,加入蛋白轉(zhuǎn)運阻斷劑(Brefeldin A,終濃度10μg/ml),于37℃含5%CO_2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5小時;設(shè)置醫(yī)用純氧(O_2,冒泡法作用)、陽性(PHA 10μg/ml刺激)、陰性(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基)對照組。培養(yǎng)結(jié)束后,用不同熒光染料標(biāo)記的抗體對細胞表面分子CD4及CD8進行染色,固定破膜后用IFN-γ及IL-4熒光抗體對細胞內(nèi)細胞因子進行染色。用流式細胞儀分別檢測CD4~+及CD8~+T淋巴細胞中IFN-γ及IL-4陽性細胞的百分率,并用CellQuest軟件分析結(jié)果。 3.統(tǒng)計分析:本研究采用2×8析因設(shè)計,即比較兩組人群(CHB患者和健康志愿者)分別接受8種不同處理(5個實驗組和3個對照組)的差異。兩組人群之間及8種不同處理組之間整體差異的比較采用析因設(shè)計資料的方差分析;兩組人群內(nèi)部各處理組整體差異的比較用單因素方差分析;兩組人群之間各個實驗組及對照組的比較采用兩獨立樣本t檢驗;同一組人群各實驗組與對照組之間的比較采用配對t檢驗;所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,檢驗水準P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果 1.兩組人群陽性對照組IFN-γ及IL-4濃度及CD8~+和CD4~+陽性細胞的比例均顯著高于其他處理組(P＜0.05)。 2.CHB患者PBMC經(jīng)過臭氧處理后分泌IFN-γ濃度的整體水平顯著高于健康志愿者(F=12.097,P=0.001),而IL-4的整體水平略低于健康志愿者,但無統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.822,P=0.179)。兩人群組內(nèi)不同臭氧濃度處理IFN-γ及IL-4濃度的整體水平均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),低濃度(4μg/mL、10μg/mL)臭氧可輕微刺激IFN-γ和IL-4的分泌,而高濃度(40μg/mL、80μg/mL)臭氧則有抑制作用。 3.CHB患者CD8~+細胞中IFN-γ陽性細胞的比例顯著高于健康對照組(F=5.101,P=0.026),CD4~+細胞中IFN-γ陽性細胞比例均數(shù)高于健康對照組(陽性對照組除外),但無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.034,P=0.845),CHB患者及健康人群組各臭氧處理組間CD8~+細胞中IFN-γ陽性細胞的比例均有顯著差異(P=0.001及P=0.043),兩組人群各臭氧處理組間CD4~+細胞中IFN-γ陽性細胞的比例均無顯著差異(P＞0.05)。兩組人群間CD8~+及CD4~+細胞IL-4陽性細胞比例總體水平無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),平均水平高低亦無明顯趨勢。CHB患者各臭氧處理組間CD8~+及CD4~+細胞中IL-4陽性細胞的比例均無顯著差異(P＞0.05),健康人群組各臭氧處理組間CD8~+及CD4~+細胞中IL-4陽性細胞的比例均有顯著差異(P=0.019及P=0.009)。隨著醫(yī)用臭氧濃度的升高IFN-γ及IL-4陽性細胞的比例逐漸降低,可見低濃度醫(yī)用臭氧對PBMC有輕微刺激作用,而高濃度時則抑制PBMC分泌細胞因子。 結(jié)論 1.臭氧體外作用對CHB患者PBMC分泌細胞因子的功能有影響,可促進Th1型細胞因子(IFN-γ)表達,而對Th2型細胞因子(IL-4)的表達無顯著作用。 2.臭氧體外對CHB患者PBMC分泌細胞因子的影響與臭氧刺激濃度劑量密切相關(guān),低濃度臭氧可增強Th1型細胞免疫,而高濃度臭氧有抑制作用。 3.臭氧體外作用CHB患者和健康人PBMC后,對其細胞因子分泌功能的影響存在差異,對CHB患者影響較大。
【圖文】：

圖1HBv感染肝細胞和復(fù)制模式圖Fig1TherePlieationeyeleofHBV(GanemD.，，etal.2004)根據(jù)HBV全基因序列差異)8%或者S基因序列差異)4%將HBV分為8個

HBv感染肝細胞免疫模式圖
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

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本文編號：2631684