發(fā)布時間：2020-03-24 15:46

【摘要】： 日本血吸蟲病是一種具有寄生性、地方性、自然疫源性、嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患型寄生蟲病。宿主接觸到含有尾蚴的疫水后,尾蚴可鉆皮進入宿主體內(nèi)并轉(zhuǎn)化為童蟲,童蟲在體內(nèi)進一步發(fā)育,待性器官成熟后雌雄合抱,移行至門脈-腸系膜靜脈系統(tǒng)定居并交配產(chǎn)卵,蟲卵主要沉積在腸壁組織和肝臟組織內(nèi)。沉著于組織內(nèi)的蟲卵的卵細(xì)胞約經(jīng)11天即發(fā)育成毛蚴。由于成熟蟲卵內(nèi)毛蚴的分泌物可透過卵殼,引起蟲卵周圍組織和血管壁發(fā)生炎癥壞死繼而形成蟲卵肉芽腫和肝纖維化,因此,蟲卵是導(dǎo)致慢性血吸蟲病甚至發(fā)展為晚期血吸蟲病的主要致病因素。 血吸蟲與宿主相互作用,采用分子/抗原偽裝、模擬,合成神經(jīng)性分子和抑制宿主免疫效應(yīng)的物質(zhì)等方式參與免疫逃避,同時血吸蟲體表還分布著某些能和宿主分子相結(jié)合的受體,利用宿主免疫反應(yīng)所提供的某些效應(yīng)分子如轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1),促進自身的發(fā)育、成熟和生殖。在多種細(xì)胞因子中,TGF-β1是目前公認(rèn)的最強的肝纖維化促進因子之一。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),脂質(zhì)過氧化物的活化可促使HSC釋放大量TGF-β1,TGF-β1反過來又引起HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)的產(chǎn)生,另外,TGF-β1還可促使竇狀內(nèi)皮細(xì)胞對纖溶酶原激活因子抑制劑合成增多、抑制HSC合成膠原蛋白酶、促使HSC表達基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)等抑制ECM的正常降解。大量間質(zhì)膠原和其他ECM成分,首先沉積于Disse間隙,最終導(dǎo)致肝纖維化。TGF-β1亦是一種免疫抑制因子,可對細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫中起著免疫抑制作用。 TGF-β超家族由一類結(jié)構(gòu)和功能都相似的多肽生長因子亞家族組成,其中TGF-β亞家族是成員之一,包括TGF-β1～6,在哺乳動物中表達并已克隆的有TGF-β1～3,種屬間具有高度的同源性。TGF-β1可以以有活性或無活性的形式存在于機體中,活化后的TGF-β1與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合通過Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。由于它在各物種間高度保守,故推測在日本血吸蟲中亦可能存在TGF-β1基因,在日本血吸蟲病性肝纖維化的形成方面起著一定的作用。 研究目的: 在本課題組已克隆、表達的SjTGF-β1成熟肽的基礎(chǔ)上,通過RACE方法獲得SjTGF-β1基因cDNA序列。利用生物學(xué)信息技術(shù)對所獲得的序列進行理論分析和功能預(yù)測;原核克隆、表達SjTGF-β1部分cDNA序列,并對表達的蛋白行免疫反應(yīng)性分析;對該基因在蟲體生長的各個時期的轉(zhuǎn)錄水平、表達水平進行檢測,以初步確定在日本血吸蟲中是否存在TGF-β1基因;同時檢測在日本血吸蟲感染小鼠不同時期肝臟的TGF-β1表達水平,以及在不同感染階段小鼠血漿中的TGF-β1,初步探討蟲源性和宿主源性的TGF-β1在日本血吸蟲致宿主肝纖維化過程中的作用。 研究方法: (1)SjTGF-β1成熟肽序列已由本課題組朱郇憫碩士擴增完成,SjTGF-β1基因序列由上海英駿生物技術(shù)(Invitrogen)有限公司通過RACE方法擴增獲得。利用GeneBank,ExPASy等對該基因序列進行生物學(xué)信息分析,設(shè)計特異性引物,將成蟲總RNA進行RT-PCR以擴增獲得SjTGF-β1基因片段,采用TA克隆的方法并將該片段亞克隆至原核表達載體pET28a(+),構(gòu)建pET28a(+)-SjTGF-β1重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)以建立pET28a(+)-SjTGF-β1重組工程菌株。利用PCR、酶切和測序方法對重組質(zhì)粒鑒定,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達,獲得重組工程菌株高效表達的目的蛋白,并對該蛋白進行免疫反應(yīng)性檢測。 (2)采用熒光定量PCR技術(shù),利用特異性引物分析SjTGF-β1基因在尾蚴、蟲卵、雌、雄成蟲和Sj感染小鼠各個時期肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平; (3)利用Western Blot技術(shù)檢測Sj雌、雄成蟲中是否表達TGF-β1蛋白,以及Sj感染各期小鼠肝臟中SjTGF-β1和小鼠TGF-β1的表達水平。 (4)利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫組織化學(xué)染色實驗分析Sj感染小鼠體內(nèi)總TGF-β1的表達水平。 研究結(jié)果: (1)將獲得的SjTGF-β1核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站上進行比對(Blastn)和分析,發(fā)現(xiàn)其中777bp大小的片段與小鼠及人的同一性(identity)分別為85%、89% ;氨基酸序列與小鼠及人的同一性分別為88%、92% ;功能結(jié)構(gòu)域序列與小鼠及人的同一性為99%和100%,具有高度的同源性。該蛋白的分子量(MW)為29.8kDa,等電點(PI)為8.61,是一堿性蛋白,具有與小鼠相似的親水性線性抗原表位。利用蛋白功能結(jié)構(gòu)檢索的方法發(fā)現(xiàn)它具有TGF-β前導(dǎo)肽的部分序列和TGF-β功能結(jié)構(gòu)域的完整序列,用同源建模的方法發(fā)現(xiàn)該蛋白的空間構(gòu)象與小鼠的完全一致。 (2)成功構(gòu)建了pET28a(+)-SjTGF-β1原核表達載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了重組融合蛋白,主要以包涵體的形式存在,重組菌和包涵體的蛋白條帶均可被兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體所識別。 (3)將Sj和小鼠的TGF-β1核苷酸序列比對后,在兩者有差異的cDNA區(qū)域設(shè)計各自的特異性引物,分別以Sj和小鼠的cDNA為模板進行特異性產(chǎn)物的擴增,以SjcDNA為模板、用SjTGF-β1引物擴增和以小鼠cDNA為模板、用小鼠TGF-β1引物擴增時,均分別得到約250bp的特異性PCR產(chǎn)物,以SjcDNA為模板、用小鼠TGF-β1引物擴增及以小鼠cDNA為模板、用SjTGF-β1引物進行擴增時,無特異性條帶,確定TGF-β1基因在日本血吸蟲雌、雄蟲中特異性轉(zhuǎn)錄。 (4)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測SjTGF-β1基因在尾蚴、蟲卵、雌、雄成蟲期均有轉(zhuǎn)錄;在肝組織中蟲體感染早期的轉(zhuǎn)錄水平高,感染21天時轉(zhuǎn)錄水平降低,隨著感染時間的延長和疾病慢性化的進程,第8周時降至最低,第12周時又逐漸上升,感染晚期又恢復(fù)至高水平。 (5)Western blot實驗結(jié)果顯示,分子量約為50kDa附近,雌、雄成蟲和各期感染小鼠的肝臟中均有一目的條帶的出現(xiàn),該條帶可能為TGF-β1的無活性潛在相關(guān)肽(LAP),且雄蟲的表達高于雌蟲,小鼠感染后期表達更為顯著。 (6)利用ELISA技術(shù)檢測感染小鼠血漿中總TGF-β1的水平隨著感染時間的延長而升高。 (7)免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)正常組小鼠肝組織切片有少量的TGF-β1表達,在感染小鼠的肝臟組織中,TGF-β1的表達水平隨著感染時間的延長表達水平逐漸增強。感染后期,蟲卵肉芽腫周圍、匯管區(qū)附近的TGF-β1的表達更高。 結(jié)論: (1)已獲得SjTGF-β1基因部分核苷酸序列長約777bp,其編碼258個氨基酸,具有部分的前導(dǎo)肽序列和完整的功能結(jié)構(gòu)域序列,與小鼠和人的氨基酸序列有高度的同源性。但仍未獲得該基因的全長序列。 (2)成功構(gòu)建原核表達載體pET28a(+)-SjTGF-β1,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達出重組融合蛋白,主要以包涵體的形式存在,可被兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體識別,具有免疫反應(yīng)性。 (3)SjTGF-β1基因在日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、成蟲各期均特異轉(zhuǎn)錄。 (4)Sj感染各期小鼠肝臟中,該基因在感染早期的轉(zhuǎn)錄水平較高,蟲體感染21天時轉(zhuǎn)錄水平下降,8周時降至最低,12周時逐漸上升,感染后期又恢復(fù)至高水平,表明SjTGF-β1在整個感染過程中可能參與了致肝纖維化的作用,同時也以自我保護的方式參與免疫逃避。 (5)Sj總蛋白中不同形式的TGF-β1可被兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體識別,表明Sj體內(nèi)有TGF-β1樣基因表達。 (6)日本血吸蟲感染小鼠血漿和肝臟中的總TGF-β1的水平隨著感染時間的延長而升高,推測日本血吸蟲病性肝纖維化有可能是蟲源性TGF-β1和宿主源性TGF-β1共同作用的結(jié)果。
【圖文】：

圖1-1 SjTGF-β1核苷酸序列與小鼠TGF-β1核苷酸序列比對結(jié)果（Bl2seq）Fig. 1-1 Bl2seq results between S.j and mouse TGF-β1 nucleotide sequences40

圖 1-2 SjTGF-β1 核苷酸序列與人 TGF-β1 核苷酸序列比對結(jié)果（Bl2seq）Fig. 1-2 Bl2seq Results between Sj and human TGF-β1 nucleotide sequences通過“In silico simulation of molecular biology experiments”中 DNA 翻譯蛋白功能分析程序分析該 cDNA 序列編碼 258 個氨基酸的多肽序列，，將該氨基酸序列利
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2;R532.2

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本文編號：2598531