【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一,在全世界范圍內感染HCV的數(shù)據(jù)是1.7億。70 80%的丙肝病毒感染是持久感染并且這其中30%的持久感染患者最終將發(fā)展成為慢性肝臟疾病,包括肝硬化,肝細胞癌等。全世界每年約有250,000～350,000人死于HCV相關終末期肝病、肝硬化及肝癌,對患者的健康和生命危害極大,早已成為嚴重的社會與公共衛(wèi)生方面的問題,但目前我們針對HCV感染的治療手段十分有限,目前主要的治療手段是干擾素加利巴韋林,但是效果不佳,而且不能用于肝硬化失代償期的患者。更令人遺憾的是,迄今為止,還沒有任何一個國家研究出可預防HCV感染的疫苗[1-3]。所以,進一步深入揭示HCV的發(fā)病機制,探尋HCV致病的分子生物學機制也便成為當今研究的熱點問題之一。 丙型肝炎病毒核心蛋白結合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein 6)是本課題組前期實驗中應用酵母雙雜交技術從肝細胞cDNA文庫中篩選得到的一種可以與丙型肝炎病毒核心蛋白相結合的蛋白[4]。前期研究發(fā)現(xiàn),HCBP6蛋白能夠上調和下調一系列不同基因的表達水平,這些差異表達的基因與細胞信號的轉導、增生、分化及生長調節(jié)密切相關。因此,對HCBP6進行更深一步的研究是十分必要的。 前期,我們從轉錄水平的調節(jié)入手對HCBP6進行了研究,應用相關的生物信息學技術對HCBP6基因啟動子上轉錄因子的結合位點進行了預測,并通過缺失等方法進一步驗證該啟動子活性區(qū)域的存在,還用EMSA(凝膠遷移率實驗)對該活性區(qū)域以及與該區(qū)域結合的轉錄因子進行驗證。現(xiàn)在我們分別構建HCBP6過表達和RNAi載體并且經過篩選得到抑制效率高的RNAi載體,通過劃痕試驗來初步證明HCBP6可能有的功能。 目的 本課題旨在研究HCBP6蛋白在肝癌細胞系HepG2增殖過程中發(fā)揮的作用,分別從構建過表達載體和RNAi載體兩個方面來證明HCBP6蛋白在HepG2細胞中可能具有的功能,給后續(xù)的功能學實驗做一個探索。 方法 1、成功構建過表達載體,在該載體上加入c-myc和His標簽為后續(xù)蛋白純化及篩選識別實驗做準備 2、構建RNAi載體,通過熒光顯微鏡來初步判定轉染效率,并且提取轉染后細胞的總RNA,逆轉錄為cDNA做Real Time PCR來檢測并篩選出抑制效率高的兩個RNAi質粒。 3、通過初步的功能學實驗來初步驗證HCBP6對于真核肝癌細胞HepG2遷移速率的影響,判斷該基因對于肝癌細胞HepG2遷移,即對腫瘤細胞的轉移的影響。 結果 1.成功獲得了HCBP6的過表達載體pcDNA3.1/myc-his(-)-HCBP6。 2.成功獲得HCBP6的含有綠色熒光蛋白的RNAi載體,且測序證實插入序列與理論序列一致。試驗組的表達活性與對照組的表達活性相比降低0.6倍。獲得了具有較高抑制效率的含有HCBP6基因序列的質粒。 3.本實驗組HepG2細胞在經劃痕試驗檢測后得到:HCBP6可以促進細胞的遷移。在0-6h每小時遷移13微米,在6-12h每小時遷移7微米,12-24h每小時遷移13微米,而陰性熒光對照組0-6h每小時遷移12微米,6-12h每小時遷移5微米,12-24h每小時遷移13微米,由此獲得實驗組細胞遷移速率與對照組相比有加快趨勢。從而初步證明HCBP6基因對于肝癌細胞HepG2遷移,即對腫瘤細胞的轉移可能有影響。 結論 1.構建pcDNA3.1/myc-his(-)-HCBP6過表達載體。 2.成功構建HCBP6的干擾載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-HCBP6。 3.HCBP6對于肝癌細胞HepG2可能具有促進細胞遷移的作用,對HCBP6功能學方面研究進行了初步探索
【圖文】：

結 果1、圖2-1 RNAi載體構建成功后轉染HepG2細胞拍攝的照片100× 500× 100×從圖2-1中我們可以看到細胞在紫外線的照射下所發(fā)出的綠色熒光，進而證明我們構建的質粒已經轉染進細胞。

放大倍數(shù)100×
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R512.63

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本文編號：2592760