【摘要】：研究背景及目的非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指無過量飲酒史,以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。其疾病譜隨病程主要包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纖維化和肝硬化。其中,纖維化階段是肝相關(guān)疾病死亡率的最高階段。因此,早期采取有效的治療手段非常重要。2018年NAFLD防治指南(中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)脂肪肝和酒精肝肝病學(xué)組)指出:存在NASH或進(jìn)展性肝纖維化需要應(yīng)用護(hù)肝藥物(熊去氧膽酸等),但其治療周期長(zhǎng)、療效仍需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)。2017年NAFLD中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)(中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會(huì))指出:存在肝損傷或者進(jìn)展性肝纖維化者,應(yīng)加用護(hù)肝和抗纖維化藥物(熊去氧膽酸、安絡(luò)化纖丸、扶正化瘀膠囊等),中西醫(yī)結(jié)合治療可以改善生活質(zhì)量,提高臨床療效。近年來的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥在防治肝纖維化有獨(dú)特的效果。遵循配伍組方規(guī)律的驗(yàn)方--抗纖軟肝方,前期研究表明,可以顯著改善慢性乙型病毒性肝炎肝纖維化及肝硬化患者的臨床癥狀與肝功能、肝纖維化指標(biāo)。同時(shí)在臨床應(yīng)用中,我們發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合熊去氧膽酸對(duì)非酒精性脂肪肝纖維化亦有較好的療效,但其治療NAFLD肝纖維化缺乏系統(tǒng)性臨床對(duì)照研究,相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此,本研究目的一是對(duì)比熊去氧膽酸單藥,抗纖軟肝方聯(lián)合熊去氧膽酸的療效和安全性。二是對(duì)比安絡(luò)化纖丸聯(lián)合熊去氧膽酸,抗纖軟肝方聯(lián)合熊去氧膽酸療效是否更具優(yōu)勢(shì)。三是對(duì)NAFLD肝纖維化不同中醫(yī)證型的療效。四是防治NAFLD肝肝纖維化作用機(jī)制。為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。研究方法本研究分為臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究?jī)纱蟛糠帧ＥR床研究采用回顧性研究方法,對(duì)同時(shí)符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)確診為非酒精性脂肪肝病的患者按用藥情況分為三組:A組:口服抗纖軟肝方聯(lián)合熊去氧膽酸;B組:口服安絡(luò)化纖丸聯(lián)合熊去氧膽酸;C組:單用熊去氧膽酸。分別分析三組患者治療前后肝功能、肝纖四項(xiàng)、Child-Pugh分級(jí)、脾臟彩超、中醫(yī)癥候積分以及A組不同中醫(yī)證型癥候積分差異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分,實(shí)驗(yàn)一:將56只SPF級(jí)Wistar大鼠自適應(yīng)喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成7組,每組8只。(1)對(duì)照組(Control,CTRL);(2)模型組(Model,MOL);(3)扶正化瘀組(Fuzheng huayu,FZHY);(4)秋水仙堿組(Colchicine,COL);(5)正常劑量抗纖軟肝方組(Normal Kangxian ruangan,N-KXRG);(6)中劑量抗纖軟肝方組(Middle Kangxian ruangan,M-KXRG)和(7)高劑量抗纖軟肝方組(High Kangxian ruangan,H-KXRG)。其中對(duì)照組大鼠正常投喂MCS對(duì)照飼料,而模型組及5個(gè)藥物預(yù)處理組的大鼠均投喂MCD飼料。在正常投喂飼料的同時(shí),各組大鼠均進(jìn)行對(duì)應(yīng)藥物灌胃處理:(FZHY組:15 g/kg/d;COL組:0.1 mg/kg/d;N-KXRG組:9.2 g/kg/d;M-KXRG組:18.4 g/kg/d;H-KXRG組:36.8 g/kg/d),而對(duì)照(CTRL)組和模型(MOL)組大鼠做對(duì)照藥物處理(均行2 m L/100g/d生理鹽水灌胃)。整個(gè)過程持續(xù)8周。8周后,分別檢測(cè)各組大鼠血清中各生化指標(biāo)(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST、γ-谷酰胺轉(zhuǎn)酞酶GGT、總膽固醇CHOL以及甘油三酯TG)的水平;ELISA分別檢測(cè)大鼠血清中透明質(zhì)酸(HA)、層連蛋白(LN)、IV-膠原蛋白(IV-C)、III-前膠原蛋白(PC-III)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白細(xì)胞介素-10(IL-10)的分泌水平;蘇木精-伊紅(HE)染色和馬森(Masson)染色檢測(cè)各組大鼠肝組織病理學(xué)變化;TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠肝組織中肝細(xì)胞凋亡情況;Western blotting檢測(cè)肝組織中線粒體凋亡信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白(Caspases家族及Bcl-2家族)的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)二:30只SPF級(jí)Wistar大鼠自適應(yīng)喂養(yǎng)一周后,被隨機(jī)分為3組(每組10只):(1)對(duì)照組(Control,CTRL);(2)模型組(Model,MOL);(3)抗纖軟肝方組(Kangxian ruangan,KXRG)。其中對(duì)照組大鼠正常投喂MCS對(duì)照飼料,而模型組及KXRG藥物預(yù)處理組的大鼠均投喂MCD飼料。在正常投喂飼料的同時(shí),各組大鼠均進(jìn)行對(duì)應(yīng)藥物灌胃處理(KXRG組:36.8 g/kg/d),對(duì)照(CTRL)組和模型(MOL)組大鼠做對(duì)照藥物處理(均行2 m L/100g/d生理鹽水灌胃)。整個(gè)過程持續(xù)8周。8周后,ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白細(xì)胞介素-6(IL-6)的分泌水平;蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)各組大鼠肝組織病理學(xué)變化;Western blotting檢測(cè)TGF-β信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白(TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3和Smad7)以及TLR4信號(hào)通路上相關(guān)蛋白(TLR4、My D88和NF-κB)的表達(dá)量。研究結(jié)果1.臨床研究結(jié)果1.1三組患者臨床綜合療效比較:A組總有效率90%,B組總有效率80%,A組與C組、B組與C組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。A組總有效率高于B組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2三組患者生化指標(biāo)比較:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和總膽紅素(TBil):三組治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。A組和B組治療后與C組治療后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT):三組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。三組治療后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.3三組患者肝纖維化指標(biāo)比較:透明質(zhì)酸(HA)和IV型膠原(IV-C):三組治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。三組治療后下降幅度依次為:A組B組C組,并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。層粘連蛋白(LN):A組和B組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。C組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。A組與B組治療后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。A組和B組治療后與C組治療后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。1.4三組患者Child-Pugh評(píng)分比較:三組治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。A組和C組治療后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。B組和C組治療后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.5三組患者彩超指標(biāo)比較:各組門脈內(nèi)徑治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。脾臟厚度:A組和B組治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P0.01)。三組治療后下降幅度依次為:A組B組C組,并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。1.6 A組各中醫(yī)證型綜合療效比較:五個(gè)中醫(yī)證型總有效率依次為:痰瘀互結(jié)證痰濕內(nèi)阻證肝郁氣滯證肝郁脾虛證濕熱蘊(yùn)結(jié)證,各組總有效率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。1.7 A組各中醫(yī)證型證候積分比較:五組證候積分治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),治療后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.實(shí)驗(yàn)一生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示,與MOL組比較,各治療組大鼠肝功能(ALT、AST和GGT)及血脂水平(CHOL和TG)均顯著降低(P0.01),尤其是H-KXRG組變化最顯著。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與MOL組比較,各治療組大鼠血清中纖維化相關(guān)蛋白均顯著降低(P0.01),促炎因子TNF-α水平顯著降低(P0.01),抑炎因子IL-10水平顯著升高(P0.01),尤其是H-KXRG組變化最為顯著。HE染色結(jié)果顯示,與MOL組比較,FZHY和COL治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受損輕,可見肝細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維增生減輕;不同濃度的KXRG治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞排列尚整齊,中央靜脈周圍可見部分肝細(xì)胞變性,病變區(qū)域面積較小,且肝細(xì)胞變性程度輕,纖維組織異常增生不明顯,其中尤以H-KXRG治療組大鼠肝組織病理變化緩解最顯著。Masson染色結(jié)果顯示,與MOL組比較,各治療組大鼠肝臟中膠原纖維組織增生呈不同程度的減少,纖維化程度有明顯好轉(zhuǎn),部分較細(xì)的藍(lán)色纖維走行于血管周圍,其中尤以H-KXRG治療組大鼠肝組織纖維增生緩解最顯著。TUNEL染色結(jié)果顯示,與MOL組比較,在各治療組中大鼠肝臟中棕褐色的凋亡細(xì)胞顯著減少,凋亡率呈現(xiàn)不同程度的下降(P0.01);尤其是H-KXRG組肝細(xì)胞凋亡率降低的最為顯著。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與MOL組相比,Caspase-3、8、9的蛋白水平在各治療組中均有不同程度的下降(P0.01)。其中在H-KXRG組中,Caspase-3、8、9的蛋白表達(dá)量下降幅度最大。促凋亡蛋白-Bax的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與Caspase家族(Caspase 3、8、9)相似,但抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL)和Bax的變化趨勢(shì)則呈現(xiàn)相反的方向。3.實(shí)驗(yàn)二ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與MOL組比較,KXRG治療組TNF-α、IL-6水平顯著降低(P0.01)。HE染色結(jié)果顯示,與MOL組比較,KXRG治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞排列尚整齊,中央靜脈周圍可見部分肝細(xì)胞變性,病變區(qū)域面積較小,且肝細(xì)胞變性程度輕,纖維組織異常增生不明顯。Western blotting結(jié)果顯示,一方面,TGF-β信號(hào)通路相關(guān)蛋白中,與MOL組比較,KXRG治療組TGF-β1、TGF-β2、Smad2和Smad3的表達(dá)水平顯著降低(P0.01),而Smad7蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.01);另一方面,TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白中,與MOL組比較,KXRG治療組中TLR4、My D88和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。研究結(jié)論1.抗纖軟肝方聯(lián)合熊去氧膽酸治療非酒精性脂肪肝肝纖維化比熊去氧膽酸單藥療效好,可以改善肝功能、脾臟腫大狀況、降低Child-Pugh評(píng)分,降低中醫(yī)證候積分、抗纖維化作用強(qiáng),安全性高。2.對(duì)比安絡(luò)化纖丸聯(lián)合熊去氧膽酸,在抗纖維化作用、改善Child-Pugh評(píng)分和繼發(fā)性脾臟腫大方面更具優(yōu)勢(shì)。3.在不同中醫(yī)證型中,痰瘀互結(jié)證療效最佳。4.抗纖軟肝方能顯著改善NAFLD肝纖維大鼠的肝功能、血脂水平、肝臟病理學(xué)變化、肝細(xì)胞凋亡情況,且作用效果比對(duì)照藥物(扶正化瘀及秋水仙堿)更加顯著。5.抗纖軟肝方能顯著改善NAFLD肝纖維大鼠血清中TNF-α、IL-6分泌水平。6.抗纖軟肝方可能是通過調(diào)控Caspases家族及Bcl-2家族相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮對(duì)NAFLD肝纖維化大鼠肝臟中肝細(xì)胞凋亡的抑制作用。7.抗纖軟肝方可能是通過調(diào)控TGF-β信號(hào)通路及TLR4信號(hào)通路防治NAFLD大鼠肝纖維化。創(chuàng)新性及科學(xué)意義首次通過臨床研究和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,初步明確抗纖軟肝方治療NAFLD肝纖維化療效以及其作用機(jī)制。為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 動(dòng)物造模及藥物處理示意圖注：Control group:對(duì)照組（以 2 mL/100g/d 生理鹽水灌胃）；Model group:模型組mL/100g/d 生理鹽水灌胃）；FZHY group:扶正化瘀組（以 15 g/kg/d 扶正化瘀膠囊提胃）；Colchicine group:秋水仙堿組（以 0.1 mg/kg/d 秋水仙堿提取物灌胃）；KXRG 抗纖軟肝方組；N-KXRG group:正常劑量抗纖軟肝方組（以 9.2 g/kg/d 抗纖軟肝提取物M-KXRG group:中劑量抗纖軟肝方組（以 18.4 g/kg/d 抗纖軟肝提取物灌胃）；H-KXRG 高劑量抗纖軟肝方組（以 36.8g/kg/d 抗纖軟肝提取物灌胃）。2.2 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)8 周后，禁食 12 h 的各組大鼠均行 60mg/kg 的戊巴比妥溶腔注射麻醉，從大鼠的腹主動(dòng)脈采集血液樣本，室溫自然凝固 304℃，1000r/min，離心 15min，分離血清，收集上清，將上清液

圖 2 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)注：A：ALT 水平變化；B：AST 水平變化；C：GGT 水平變化；D：CHOL 水平變化；E：TG 水平變化。CTRL：對(duì)照組；MOL：模型組；FZHY：扶正化瘀治療組；COL 秋水仙堿治療組；N-KXRG：正常劑量抗纖軟肝方治療組；M-KXRG：中劑量抗纖軟肝方治療組；H-KXRG：高劑量抗纖軟肝方治療組。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）的形式表示（n=8）。與 CTRL 組比較，bP＜0.01；與 MOL 比較，dP＜0.01；與 FZHY 組比較，fP＜0.01；與 COL 組比較，hP＜0.01；與 N-KXRG組比較，jP＜0.01；與 M-KXRG 組比較，lP＜0.01。3.2 各組大鼠血清 ELISA 檢測(cè)通過血清 ELISA 檢測(cè)，評(píng)估肝纖維化及炎癥反應(yīng)的水平。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，，一方面，如圖 3A-2D 所示，與 CTRL 組比較，MOL 組
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2592563