本文關(guān)鍵詞：腹瀉患者和生態(tài)環(huán)境香港海鷗菌的檢測(cè)及多序列分型研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學(xué)》 2015年

腹瀉患者和生態(tài)環(huán)境香港海鷗菌的檢測(cè)及多序列分型研究

王祉蘊(yùn)  

【摘要】：研究背景香港海鷗菌(Laribacter hongkongensis, LH)是一種可能致人類嚴(yán)重腹瀉的新發(fā)現(xiàn)病原菌。該菌2001年首次在香港肝硬化病人的肝和血液中分離到并被鑒定為新種屬,隨著對(duì)該菌研究的進(jìn)一步深入,除腹瀉病人外,香港海鷗菌還在淡水產(chǎn)品中(如草魚、鳙魚、虎紋蛙等)及環(huán)境水體中被檢測(cè)出,并被證實(shí)進(jìn)食魚類和異地旅游是感染香港海鷗菌的危險(xiǎn)因素。香港海鷗菌作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的病原菌,其可能的源頭、不同宿主之間可能存在的關(guān)聯(lián)、造成人類的可能感染方式,不同來(lái)源的菌株間的本質(zhì)差異、遺傳多樣性、耐藥性等問(wèn)題都亟待解決。目前對(duì)LH只能采用基因分型方法進(jìn)行分型,如PFGE分型、ERIC-PCR分型、MLST分型,馮嘉麗在論文中對(duì)LH在廣州市售涉淡水產(chǎn)品中分離株進(jìn)行PFGE和ERIC-PCR分型。香港大學(xué)Woo等[3]針對(duì)香港淡水魚及人分離株進(jìn)行MLST分型。基于分子分型的LH分子特征研究,比表型分型更加精細(xì)和穩(wěn)定,既能用于流行病學(xué)調(diào)查和疾病爆發(fā)的溯源,還能從遺傳進(jìn)化的角度分析LH菌株間的關(guān)系。而目前,中國(guó)大陸尚缺乏LH陽(yáng)性株的MLST分型結(jié)果及相關(guān)研究分析。研究目的1.收集廣州市醫(yī)院門診腹瀉病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行香港海鷗菌檢測(cè)并收集相關(guān)信息,計(jì)算發(fā)病率以了解廣州地區(qū)香港海鷗菌所致腹瀉的發(fā)病狀況,并探索危險(xiǎn)因素；2.采集廣州市的淡水魚、食用蛙、食用螺(中華圓田螺、福壽螺)進(jìn)行香港海鷗菌檢測(cè),收集陽(yáng)性菌株,以了解目前廣州市淡水產(chǎn)品中香港海鷗菌的感染情況及各宿主之間聯(lián)系；3.檢測(cè)廣州市環(huán)境水體中香港海鷗菌以探索其攜帶狀況；4.為深入闡明LH的耐藥性及分子遺傳特征,進(jìn)行以下研究：分析LH分離株抗生素耐藥表型；運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技術(shù)對(duì)不同宿主來(lái)源的LH分離株進(jìn)行分型分析,評(píng)價(jià)菌株間的遺傳親緣關(guān)系。研究方法1.廣州市某綜合醫(yī)院門診腹瀉病人糞便標(biāo)本、廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)淡水產(chǎn)品(淡水魚、食用蛙、福壽螺)及水庫(kù)水樣中香港海鷗菌檢出情況的調(diào)查研究1.1標(biāo)本收集和資料獲取：2013年5月至2014年11月收集醫(yī)院感染疾病科門診,消化科門診和急診科胃腸炎腹瀉患者的糞便標(biāo)本；病人的一般情況、臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)資料通過(guò)自制的《感染性腹瀉調(diào)查表》獲得；2013年12月至2014年5月選擇廣州市4家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),采集淡水產(chǎn)品,包括草魚、虎紋蛙、中華圓田螺,所采樣品單獨(dú)采集后室溫狀態(tài)即時(shí)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。在廣州市內(nèi)各區(qū)(白云區(qū)、天河區(qū)、黃浦區(qū)、花都區(qū)、番禺區(qū)、蘿崗區(qū))分別選擇一個(gè)水庫(kù)(和龍水庫(kù)、新塘水庫(kù)、黃埔水庫(kù)、金鐘水庫(kù)、渾坑水庫(kù)、新陂水庫(kù))共6個(gè)水庫(kù)進(jìn)行采樣,所取水樣按無(wú)菌原則采集后立即送檢。1.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)：1.2.1香港海鷗菌培養(yǎng)及生化鑒定收集到的腹瀉病人標(biāo)本所采集糞便標(biāo)本立即放入Cary-blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基,48h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定,糞便標(biāo)本直接劃線改良頭孢哌酮酮MacConkey瓊脂(CMA)平皿,頭孢哌酮濃度為16mg/L, CMA培養(yǎng)皿置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí),試驗(yàn)均以HKU1菌株(香港大學(xué)微生物學(xué)系袁國(guó)勇教授惠贈(zèng))作為陽(yáng)性對(duì)照菌株�？梢杉�(xì)菌進(jìn)行革蘭染色、過(guò)氧化氫酶、氧化酶、脲酶和三糖鐵等關(guān)鍵生化試驗(yàn)篩選,以上均符合者再采用API鑒定。淡水產(chǎn)品標(biāo)本在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)相應(yīng)處理后得到的腸道棉拭子接種LH選擇性培養(yǎng)基,及改良頭孢哌酮MacConkey瓊脂(CMA)平皿,后檢測(cè)步驟同上。水庫(kù)水樣采集需在24h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),采用濾膜法進(jìn)行加壓過(guò)濾,然后將濾膜置于改良頭孢哌酮MacConkey瓊脂(CMA)平皿進(jìn)行培養(yǎng),后檢測(cè)步驟同上。1.2.2香港海鷗菌基因鑒定1.2.2.1特異性片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段是香港海鷗菌16S rRNA基因特異性序列,上游序列為：5'-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3',下游序列為：5'-TCTCTTCGAGGTTCGGTA-3',擴(kuò)增片段大小為550bp。反應(yīng)體系：總體積：50μL,其中10xPCR緩沖液25mmol/L MgC12 4μL,2.5 mmol/L dNTPs 4μL,5U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL,0.6mmol/L引物各1μL,模版DNA 5μL,雙蒸水29.75μL。反應(yīng)條件為94.0℃ 5min,94.0℃ 30S,53.0℃ 40S,72.0℃ 40S,35個(gè)循環(huán),72.0℃ 5min。用DL2000作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Marker,以LH人源株(HKUI,香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系袁國(guó)勇教授惠贈(zèng))為陽(yáng)性對(duì)照,以大腸桿菌ATCC25922為陰性對(duì)照。1.2.2.3 16S rRNA PCR擴(kuò)增與測(cè)序方法同上,引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[1],擴(kuò)增16S rRNA基因序列,序列為：LPW264:5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', LPW265: 5'-GNTACCTTGTTACGACTT-3',長(zhǎng)度為1495bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。2.紙片擴(kuò)散法確定LH人源分離株的抗生素敏感性采用WHO推薦的K-B紙片擴(kuò)散法測(cè),判定標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)CLSI/NCCLSM100-519抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2009版)腸桿菌科抑制圈直徑的解釋標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。敏感(susceptible,s)率、中介(intermediate,I)率、耐藥(resistant,R)率分別用S%、I%、R%表示。并用大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923作質(zhì)控。3.香港海鷗菌分離株的MLST分型選擇本實(shí)驗(yàn)室保存的采集自廣州市、江門市的香港海鷗菌分離株,提取DNA并純化,采用港大的香港海鷗菌MLST方案,即選擇rho、acnB、trpE、ftsH、 thiC、ilvC、eno等7個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行正反測(cè)序后,進(jìn)行拼接,得到等位基因序列,將其提交港大進(jìn)行比對(duì)分析,獲得相應(yīng)的等位基因編號(hào)及根據(jù)等位基因譜得出的ST型號(hào)。采用eBURST、START2、 mega6等軟件對(duì)等位基因編號(hào)、ST型號(hào)、核苷酸序列進(jìn)行分析。研究結(jié)果1.廣州市人群現(xiàn)場(chǎng)LH研究于2013年5月-2014年11月采集廣州市某綜合醫(yī)院門診腹瀉患者545例(編號(hào)：1004-1548)糞便進(jìn)行香港海鷗菌的檢測(cè),目前未發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌感染陽(yáng)性病例。2.廣州市部分淡水產(chǎn)品LH檢測(cè)結(jié)果324份淡水產(chǎn)品中共檢出香港海鷗菌53株,陽(yáng)性率為16.36%(53/324),其中草魚256份,香港海鷗菌在草魚的陽(yáng)性率為17.97%(46/256),15只虎紋蛙中檢出7只陽(yáng)性,陽(yáng)性率為46.67%。中華圓田螺53份,未檢出LH。3.廣州市各區(qū)水庫(kù)水樣LH檢測(cè)結(jié)果于白云區(qū)和龍水庫(kù)的水樣培養(yǎng)分離出香港海鷗菌,經(jīng)過(guò)生化鑒定及16SrRNA基因序列測(cè)定,,并與GenBank中登錄的香港海鷗菌(菌株號(hào)HKUI)進(jìn)行序列比對(duì),其同源性均為99%,這是目前廣東省廣州市水庫(kù)中首次發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌。水庫(kù)分離株菌落形態(tài)：CMA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48h后,菌落呈灰白色、半透明、圓形、略凸起、直徑在1.0一1.5mm之間、光滑、不粘連,略顯濕潤(rùn),革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性,形狀呈螺旋桿狀或展翅海鷗形狀。水庫(kù)分離株的生化檢測(cè)結(jié)果：均為革蘭氏陰性菌,氧化酶、過(guò)氧化氫酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原酶、甘露醇、葡糖酸鹽、癸酸鹽等陽(yáng)性,三糖鐵、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、吲哚、3-羥基丁酮、明膠酶、p一半乳糖苷酶、纖維糖、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、葡萄糖等陰性。4.廣州市分離株藥敏結(jié)果54株LH分離株對(duì)10個(gè)種類常用抗生素中的19種藥物均表現(xiàn)不同程度的耐藥性。耐藥率從高到低依次如下：頭孢哌酮(53/54,98.15%),頭孢唑啉(52/54,96.30%),頭孢噻吩(51/54,94.44%),氨芐西林(44/54,81.48%),利福平(38/54,70.37%),紅霉素(15/54,27.78%),哌拉西林(11/54,20.37%),四環(huán)素(10/54,18.52%),頭孢他啶(8/54,14.81%),環(huán)丙沙星(7/54,12.96%),頭孢吡肟(6/54,11.11%),氨曲南(5/54,9.26%),鏈霉素(4/54,7.41%),頭孢呋辛(4/54,7.41%),復(fù)方新諾明(3/54,5.56%),氯霉素(2/54,3.70%),亞胺培南(1/54,1.85%),阿米卡星(1/54,1.85%),慶大霉素(0/54,0%)。各種分離株均發(fā)現(xiàn)對(duì)頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)耐藥,大多數(shù)對(duì)第一、三代頭孢菌素表現(xiàn)耐藥,而對(duì)第二、四代頭孢菌素表現(xiàn)較低的耐藥性。大多數(shù)分離株對(duì)利福平表現(xiàn)耐藥。5.LH分離株MLST分型結(jié)果5.1 ST型分布結(jié)果ST型分布：本研究LH分離株共分為72個(gè)ST型,3株人源分離株中,產(chǎn)生3個(gè)ST型,其中一個(gè)為已發(fā)現(xiàn)ST型,另外兩個(gè)ST型為新發(fā)現(xiàn)型號(hào)；55株魚分離株中,產(chǎn)生23個(gè)基因型,其中,其中有21個(gè)新發(fā)現(xiàn)型號(hào),其余2個(gè)已發(fā)現(xiàn)型為ST42、ST45；4株福壽螺分離株,產(chǎn)生4個(gè)基因型,均為新型；51株蛙源分離株,產(chǎn)生42個(gè)基因型,出現(xiàn)36個(gè)新ST型。本次研究的香港海鷗菌分離株中,ST45型出現(xiàn)頻率最高,共28個(gè)LH分離株,其中僅有魚來(lái)源分離株,地點(diǎn)分布于廣州市與江門市。其次為ST117,共4個(gè)LH分離株,且全部屬于蛙來(lái)源分離株,采樣地點(diǎn)均在廣州市。再次,ST42、ST23、 ST106均有3個(gè)LH分離株。ST101在江門市腹瀉患者來(lái)源LH分離株JM-623與廣州市野生虎紋蛙來(lái)源LH分離株GZ-W59中均出現(xiàn),提示其可能的傳播途徑。5.2 eBURST軟件進(jìn)一步分析結(jié)果運(yùn)用eBURST軟件對(duì)等位基因號(hào)及ST型號(hào)進(jìn)行分析,可以將所有ST型分成10組克隆復(fù)合體,第一組(group 1) ST45為預(yù)測(cè)基礎(chǔ)型(概率為83%)。第二組(group2)包括ST42、ST156、ST143 (ST42為預(yù)測(cè)基礎(chǔ)型)；第三組(group3)包括ST128、ST137;第四組(group4)包括ST123、ST122;第五組(group5)包括ST119、ST150;第六組(group6)包括ST117、ST159;第七組(group7)包括ST112、ST160;第八組(group8)包括ST102、ST135;第九組(group9)包括ST101、ST27;第十組(group10)包括ST23、ST149。5.3 START2軟件進(jìn)一步分析結(jié)果5.3.17個(gè)管家基因基因成分及多態(tài)位點(diǎn)分析對(duì)于香港海鷗菌的各分離株中所選7個(gè)管家基因的等位基因進(jìn)行堿基組成分析,各管家基因之間與分離株之間的平均G+C%含量差異不大,提示未出現(xiàn)從外源的細(xì)菌或其他物種的基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。對(duì)rho、trpE、ilvC、thiC、eno,其dN/dS值0.05(平均值：0.0221,0.0000-0.0417), acnB、ftsH的dN/dS值1。5.3.27個(gè)管家基因基因重組測(cè)試結(jié)果rho、thiC等2個(gè)管家基因?qū)?yīng)SSCF P值與SSUF P值均0.05,其余5個(gè)管家基因acnB、ftsH、trpE、ilvC、eno等的SSCF P值與SSUF P值均0.05,二值提示結(jié)論一致,增加了thiC基因重組的可信度。5.3.3 7個(gè)管家基因的連鎖不平衡分析魚來(lái)源LH分離株、蛙來(lái)源LH分離株及螺來(lái)源LH分離株中的等位基因均存在連鎖不平衡現(xiàn)象,表明LH分離株不同管家基因之間相互不獨(dú)立。而且魚來(lái)源分離株ISA最大,其次是螺來(lái)源分離株ISA,最后是蛙來(lái)源分離株ISA。人源分離株(3株)的等位基因顯示連鎖平衡,但由于其菌株數(shù)目有限,結(jié)果可靠性值得考究。對(duì)于所有分離株進(jìn)行連鎖不平衡分析：方法1 (Haubold):ISA =0.583(P=0.000);方法2 (Maynard Smith):ISA=3.4978(P=0.000)。兩種方法的結(jié)果一致顯示,所有分離株的等位基因存在連鎖不平衡現(xiàn)象,表明LH分離株不同基因座之間相互不獨(dú)立。5.3.4所有香港海鷗菌分離株聚類分析廣州市內(nèi)首次檢出的水庫(kù)株GZ-SHUI (ST151型)與廣州市內(nèi)多株魚來(lái)源分離株及蛙來(lái)源分離株有較近的親緣關(guān)系。作為新發(fā)現(xiàn)的江門市來(lái)源的福壽螺分離株,其中JM-L16與JM-L143親緣關(guān)系很近,JM-L10與其的親緣關(guān)系僅次之,JM-L2的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),追溯采樣地點(diǎn),發(fā)現(xiàn)JM-L143采自東郊魚塘,而其余3株則采自西郊稻田。人源分離株HZ242. JM-623. JM-679的ST型分別為ST100、ST101、ST63,其中ST63在香港也有檢出,為魚源分離株,ST100、ST101為新型,HZ242的親緣關(guān)系與廣州2株蛙源分離株GZ-W334、GZ-W338相近,JM-623與廣州1株蛙源分離株GZ-W59的ST型一致。廣州市來(lái)源香港海鷗菌分離株與江門市來(lái)源香港海鷗菌分離株存在很多相同ST型,如ST45、ST42、ST106、ST101等,其中ST45及ST42型均在香港有檢出過(guò),且為優(yōu)勢(shì)ST型。研究結(jié)論1.本次研究對(duì)廣州市某綜合醫(yī)院545例門診腹瀉患者糞便進(jìn)行香港海鷗菌的檢測(cè),目前未發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌感染陽(yáng)性病例。324份淡水產(chǎn)品中共檢出香港海鷗菌53株,其中香港海鷗菌在草魚的陽(yáng)性率為17.97%,虎紋蛙中陽(yáng)性率為46.67%。中華圓田螺中未檢出。本研究在廣州市水庫(kù)水樣中分離出香港海鷗菌,證明了在天然水環(huán)境中存在香港海鷗菌。因此,攜帶香港海鷗菌的水庫(kù)水可能為香港海鷗菌的感染渠道。同時(shí),水庫(kù)是淡水魚類等淡水產(chǎn)品的常見生活環(huán)境,因而作為香港海鷗菌傳播途徑的環(huán)境媒介,對(duì)香港海鷗菌的流行具有重要意義。2.各種分離株均發(fā)現(xiàn)對(duì)頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)耐藥,大多數(shù)對(duì)第一、三代頭孢菌素表現(xiàn)耐藥,而對(duì)第二、四代頭孢菌素表現(xiàn)較低的耐藥性。大多數(shù)分離株對(duì)利福平表現(xiàn)耐藥。大多數(shù)分離株對(duì)亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星等藥物較敏感。3.本研究所采用的MLST研究方案為選取rho、ancB、ftsH、trpE、ilvC、 thiC、eno等7個(gè)管家基因,7個(gè)管家基因的多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)目為298個(gè)。本次研究針對(duì)7個(gè)管家基因進(jìn)行基因重組分析,提示rho、thiC等2個(gè)管家基因可能存在基因內(nèi)基因重組現(xiàn)象；同時(shí)其余5個(gè)管家基因acnB、ftsH、trpE、ilvC、eno等未存在基因內(nèi)基因重組現(xiàn)象。該次研究針對(duì)各管家基因進(jìn)行連鎖不平衡分析,結(jié)果顯示等位基因均存在連鎖不平衡現(xiàn)象,表明LH分離株不同管家基因之間相互不獨(dú)立。本次對(duì)香港海鷗菌進(jìn)行MLST分型,LH分離株采自廣州市與江門市,選取人源、魚源、蛙源、螺源、水庫(kù)來(lái)源香港海鷗菌菌株進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示共檢出63個(gè)新ST型(ST99-ST161),說(shuō)明菌株異質(zhì)性較高,同時(shí)對(duì)香港海鷗菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了補(bǔ)充,可供其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行數(shù)據(jù)分享及比較。廣州市內(nèi)檢出的水庫(kù)株GZ-SHUI (ST151型)與廣州市內(nèi)多株魚來(lái)源分離株及蛙來(lái)源分離株有較近的親緣關(guān)系,可能有共同的遺傳祖先。提示水庫(kù)水與魚、蛙同時(shí)作為海鷗形菌的儲(chǔ)存宿主,可能其間存在傳播環(huán)。作為新發(fā)現(xiàn)的江門市來(lái)源的福壽螺分離株,產(chǎn)生4個(gè)ST型,均為新型,其親緣關(guān)系與采樣地點(diǎn)無(wú)關(guān)。人源分離株HZ242的親緣關(guān)系與廣州2株蛙源分離株相近,人源分離株JM-623與廣州1株蛙源分離株ST型一致。該結(jié)果提示人感染香港海鷗菌可能與進(jìn)食未煮熟的魚、蛙等導(dǎo)致。LH的某些ST型存在地域較廣,且出現(xiàn)頻率較高,可以為今后的優(yōu)勢(shì)流行株的預(yù)測(cè)提供科學(xué)依據(jù),也可對(duì)這若干種優(yōu)勢(shì)ST型對(duì)應(yīng)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究其毒力、致病性以及耐藥性的相關(guān)特征,為今后的防治策略的制定提供基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R574.62;R446.5
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：腹瀉患者和生態(tài)環(huán)境香港海鷗菌的檢測(cè)及多序列分型研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：214257