本文關鍵詞：PTEN過表達及突變對肝星狀細胞黏附與遷移的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華北理工大學》 2015年

PTEN過表達及突變對肝星狀細胞黏附與遷移的影響

任昌鎮(zhèn)  

【摘要】：目的探討過表達的野生型第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)及其突變體G129E基因(僅保留蛋白磷酸酶活性而喪失了脂質磷酸酶活性)對體外培養(yǎng)的活化肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)黏附與遷移的影響。方法利用293A細胞擴增實驗所需的腺病毒(Ad-PTEN、Ad-G129E、AdGFP),并測定滴度;以腺病毒為載體將具有雙重特異性磷酸酶活性的野生型PTEN基因及僅保留了蛋白磷酸酶活性的PTEN突變體G129E基因轉染體外培養(yǎng)的活化大鼠HSC(HSC-T6株);采用Western blot檢測HSC的PTEN蛋白表達;應用甲苯胺藍染色法及MTT比色法測定HSC黏附能力;采用細胞劃痕修復實驗測定HSC的平面遷移能力;應用Transwell小室測定HSC的跨膜遷移能力。所有資料均應用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用LSD檢驗,P0.05即認為有統(tǒng)計學意義。實驗分組如下:①對照組(Control組):病毒轉染時以DMEM基礎培養(yǎng)基代替腺病毒;②空病毒組(Ad-GFP組):轉染表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的載體空病毒;③PTEN重組腺病毒組(Ad-PTEN):轉染攜帶野生型PTEN基因并表達GFP的重組腺病毒;④G129E重組腺病毒組(Ad-G129E組):轉染攜帶G129E基因并表達GFP的重組腺病毒。結果1通過反復感染293A細胞的方法,獲得實驗所需腺病毒液Ad-GFP、AdPTEN及Ad-G129E,其滴度分別為:1.6×109pfu/m L、1.3×109pfu/m L、1.4×109pfu/m L。2 M.O.I.值100時,腺病毒感染HSC后48h,計數(shù)GFP熒光陽性表達細胞,測的Ad-GFP、Ad-PTEN及Ad-G129E各組腺病毒感染率均80%。3腺病毒轉染后48h,應用Western blot技術檢測各組HSC的PTEN蛋白表達顯示:Ad-PTEN組(1.08±0.07)、Ad-G129E組(0.97±0.04)明顯高于Control組(0.56±0.05)及AdGFP(0.69±0.07),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而Control組與Ad-GFP組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間均無顯著差異(P0.05)。4甲苯胺藍染色法測定HSC黏附力顯示:在腺病毒感染HSC 48h,與Control組相比,Ad-GFP組細胞黏附抑制率(1.89±0.88)%,無顯著差異(P0.05);Ad-PTEN組細胞黏附抑制率(20.38±4.37)%及Ad-G129E組細胞黏附率(19.57±3.78)%顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);但Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間細胞黏附率無顯著差異(P0.05)。5 MTT比色法檢測HSC黏附力顯示:與Control組相比,Ad-GFP組細胞黏附抑制率(6.17±4.98)%,無顯著差異(P0.05);Ad-PTEN組細胞黏附抑制率(38.13±6.93)%及Ad-G129E組細胞黏附率(35.83±4.24)%顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);但Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間細胞黏附率無顯著差異(P0.05)。6細胞劃痕修復實驗結果顯示:劃痕后12h各組HSC均有遷移,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);劃痕后24h HSC由兩側向中間遷移距離,Ad-PTEN組(332.35±6.23μm)、Ad-G129E組(336.77±5.25μm)明顯低于Control組(391.34±10.41μm)及Ad-GFP組(392.66±10.41μm)(P0.05),而Control組與Ad-GFP組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間均無顯著差異(P0.05);劃痕后48h HSC由兩側向中間遷移距離,與Control組(551.68±8.91μm)相比,Ad-PTEN組(468.74±19.29μm)及Ad-G129E組(462.48±13.47μm)明顯減低(P0.05),且較24小時降低更加明顯,而Ad-GFP組(550.81±11.55μm)與Control組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。7 Transwell小室細胞跨膜遷移實驗結果顯示:Ad-PTEN組跨膜細胞數(shù)(38.67±4.50)、Ad-G129E組跨膜細胞數(shù)(33.33±3.83)較Control組(67.67±6.28)及Ad-GFP組(64.67±5.53)顯著減少(P0.05),而Ad-PTEN組與Ad-G129E組及Control組與Ad-GFP組之間跨膜細胞數(shù)均無顯著差異(P0.05)。結論1野生型PTEN過表達可顯著抑制活化HSC黏附、遷移。2 PTEN的突變體G129E對活化HSC黏附、遷移的抑制作用,與野生型PTEN相比無顯著差異。3 PTEN基因通過其蛋白磷酸酶活性對活化HSC黏附、遷移發(fā)揮抑制作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

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本文編號：200269