本文關(guān)鍵詞：慢病毒載體Pax6-EGFP構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞

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【摘要】：背景:Pax6基因是影響眼發(fā)育、分化的關(guān)鍵基因,獲得過表達Pax6基因的穩(wěn)定細胞株是研究其對骨髓間充質(zhì)干細胞分化作用的首要任務(wù),也是干細胞替代治療的研究基礎(chǔ)。目的:構(gòu)建重組慢病毒載體Pax6-EGFP,體外轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞,檢測Pax6基因在人骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達情況。方法:利用PCR法從人Pax6 cD NA基因克隆載體p GEM-PAX6上擴增Pax6目的片段,將其與XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切的慢病毒載體pH IV-EGFP連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α,挑取陽性克隆提取質(zhì)粒,測序鑒定。經(jīng)293T細胞包裝后,收集含病毒顆粒的上清液,體外轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞,同時設(shè)立陰性對照組(p HIV-EGFP空載體)。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功,Real time PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞Pax6基因的表達。結(jié)果與結(jié)論:(1)酶切電泳及基因測序證實攜帶Pax6基因的慢病毒載體構(gòu)建成功,包裝后獲得滴度為3×109 pfu/L的Pax6-EGFP重組載體;(2)轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞后,在熒光顯微鏡下可以發(fā)出綠色熒光,且熒光強度不隨培養(yǎng)時間延長而衰退;(3)經(jīng)Real time PCR檢測,被轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)有Pax6基因表達,表明慢病毒轉(zhuǎn)染是一種安全高效的基因修飾手段,能夠使外源基因整合到宿主細胞基因組中。
【作者單位】： 深圳市眼科醫(yī)院眼外傷科暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院深圳大學眼視光學院深圳眼科學重點實驗室;暨南大學;
【關(guān)鍵詞】： 骨髓 間質(zhì)干細胞 成對盒轉(zhuǎn)錄因子類 慢病毒屬 轉(zhuǎn)染 綠色熒光蛋白質(zhì)類 組織工程 干細胞 骨髓干細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞 過表達 Pax基因 慢病毒 基因轉(zhuǎn)染 綠色熒光蛋白
【基金】：深圳市知識創(chuàng)新計劃基礎(chǔ)研究計劃項目(JCYJ20130401152829828)~~
【分類號】：R77
【正文快照】： 0引言Introduction性眼病的理想細胞,在這方面的研究也獲得許多進展:外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy,經(jīng)體內(nèi)、外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞所得的角膜上皮細TON)是外傷導致的一種眼部并發(fā)癥,它的特點在于外胞和角膜基質(zhì)細胞能參與修復(fù)受損角膜;骨髓間充質(zhì)傷后視力喪，

本文編號：692871