本文關(guān)鍵詞：慢病毒ShRNA干擾PGC-1α表達(dá)在DR中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究通過(guò)檢測(cè)在AGEs環(huán)境中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926、RPE細(xì)胞株ARPE-19以及DM大鼠視網(wǎng)膜中PGC-1α、VEGF、及EGR-1的表達(dá)變化,探究PGC-1α在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展中的作用,及PGC-1α、VEGF與EGR-1間的關(guān)系,為DR的發(fā)生發(fā)展及治療提供一定理論依據(jù)。方法確定PGC-1αsi-RNA序列:sense,5’-AAGACGGAUUGCCCUCAUUUGtt-3’;antisense,5’-CAAAUGAGGGCAAUCCGUCUUtt-3’。合成含PGC-1α序列的單鏈DNA,然后退火配對(duì)產(chǎn)生雙鏈,再通過(guò)其兩端所含酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的RNAi慢病毒載體上;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定陽(yáng)性重組子后,送測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)確認(rèn)正確的克隆即為構(gòu)建成功PGC-1αRNAi慢病毒載體。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞,經(jīng)AGEs(1g/L)干預(yù)4d后,加入慢病毒包裝的PGC-1αSh RNA感染后,分普通培養(yǎng)液培養(yǎng)及AGEs持續(xù)培養(yǎng),具體實(shí)驗(yàn)分組如下:A.普通培養(yǎng)液培養(yǎng);B.AGEs培養(yǎng)(1g/L);C.AGEs培養(yǎng)4天后PGC-1αRNA干擾1.繼而更換正常培養(yǎng)液培養(yǎng);2.持續(xù)AGEs(1g/L)培養(yǎng)。檢測(cè)慢病毒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、RPE細(xì)胞的感染率。采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各組細(xì)胞PGC-1α、VEGF及EGR-1的表達(dá)情況。提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,進(jìn)行數(shù)據(jù)歸納和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SD大鼠腹腔注射STZ制作糖尿病模型。對(duì)DM大鼠行玻璃體腔注射慢病毒包裝的PGC-1αsh RNA,具體實(shí)驗(yàn)分組:A.正常組(10只)B.糖尿病組(1.糖尿病4W組(10只)2.糖尿病8W組(10只))C.RNAi組(1.DM 4周玻璃體腔注射PGC-1α干擾RNA10天后取材(10只)2.DM 8周玻璃體腔注射PGC-1α干擾RNA10天后取材(10只))。觀察大鼠玻璃體腔轉(zhuǎn)染情況:玻璃體腔注射一周后,行眼球冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察sh RNA慢病毒對(duì)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)染情況。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜PGC-1α、VEGF及EGR-1的表達(dá)情況。提取大鼠視網(wǎng)膜總RNA,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,進(jìn)行數(shù)據(jù)歸納和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果陽(yáng)性重組子測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)完全正確,表明靶向PGC-1α的RNA干擾慢病毒制備成功。靶向PGC-1α的慢病毒Sh RNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞2天后,在熒光顯微鏡下觀察同一視野的熒光和可見(jiàn)光照片,可見(jiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染率高達(dá)95%以上。在MOI=100 polybreen(+)時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和RPE細(xì)胞感染效果好,感染率達(dá)80%—85%。免疫細(xì)胞化學(xué)與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在正常內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞在AGEs培養(yǎng)后PGC-1α、VEGF與EGR-1在蛋白及m RNA水平升高,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);在使用慢病毒Sh RNA干擾PGC-1α后更換普通培養(yǎng)液培養(yǎng),PGC-1α、VEGF與EGR-1均較AGEs培養(yǎng)后下降(p0.05);繼續(xù)使用AGEs培養(yǎng),PGC-1α、VEGF與EGR-1表達(dá)雖比AGEs培養(yǎng)組下調(diào)(p0.05),但仍較更換普通培養(yǎng)液組升高(p0.05)。玻璃體腔注射后視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)染率高,熒光顯微鏡下觀察顯示高熒光。免疫組織化學(xué)與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果顯示糖尿病組PGC-1α、VEGF與EGR-1較正常組在蛋白及m RNA水平升高,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且PGC-1α和VEGF的表達(dá)均隨病程進(jìn)展而表達(dá)增加。RNAi組PGC-1α蛋白及m RNA水平均較糖尿病組下降(p0.05),VEGF與EGR-1在玻璃體腔注射慢病毒Sh RNA干擾PGC-1α后較同病齡糖尿病組未見(jiàn)明顯改變。結(jié)論1.在正常內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表達(dá),AGEs環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞中PGC-1α、EGR-1及VEGF表達(dá)均明顯升高。2.使用PGC-1αSh-RNA慢病毒轉(zhuǎn)染經(jīng)干預(yù)AGEs過(guò)的細(xì)胞后,細(xì)胞中PGC-1α在蛋白與m RNA水平表達(dá)均下調(diào)至正常水平,同時(shí)EGR-1和VEGF在蛋白與m RNA水平表達(dá)也下調(diào)至正常水平。可見(jiàn)PGC-1α與EGR-1、VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞中表達(dá)存在正相關(guān)。3.即使經(jīng)PGC-1αSh-RNA慢病毒干擾,但若內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞仍持續(xù)處于AGEs環(huán)境中,PGC-1α、VEGF與EGR-1表達(dá)雖較AGEs培養(yǎng)組下調(diào),但仍無(wú)法回歸到正常水平,推斷因AGEs的堆積造成“代謝記憶”。4.在DM大鼠視網(wǎng)膜中PGC-1α、EGR-1及VEGF表達(dá)均明顯上調(diào),且PGC-1α與VEGF的表達(dá)隨DM病程進(jìn)展而增加。5.在對(duì)DM大鼠進(jìn)行RNA干擾后,大鼠視網(wǎng)膜中PGC-1α較同病齡的DM大鼠下調(diào),但EGR-1和VEGF與同病齡的DM大鼠比較無(wú)明顯變化。推測(cè)因體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,DM發(fā)生后在多信號(hào)通路啟動(dòng)及“代謝記憶”產(chǎn)生的情況下,EGR-1及VEGF表達(dá)無(wú)法回到正常水平。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 PGC-1α RNA干擾 VEGF EGR-1
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 英文縮略一覽表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一部分 PGC-1α ShRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定11-15
• 前言11-12
• 材料及方法12-14
• 結(jié)果14-15
• 第二部分 慢病毒ShRNA干擾PGC-1α 在內(nèi)皮細(xì)胞與RPE細(xì)胞中的表達(dá)15-35
• 前言15-17
• 材料及方法17-25
• 結(jié)果25-35
• 第三部分 慢病毒ShRNA干擾PGC-1α 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)35-47
• 前言35-36
• 材料與方法36-40
• 結(jié)果40-47
• 討論47-53
• 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 綜述59-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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  本文關(guān)鍵詞：慢病毒ShRNA干擾PGC-1α表達(dá)在DR中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：270169