【摘要】：第一章DNA甲基化芯片聯(lián)合表達(dá)譜芯片篩選鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因 目的：探討DNA甲基化與鼻咽癌紫杉醇耐藥的相關(guān)性,采用DNA甲基化芯片聯(lián)合基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系CNE-1/TaxoU HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol與相應(yīng)親本細(xì)胞的甲基化譜和基因表達(dá)譜差異,并篩選出鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因。 方法：使用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞整體甲基化水平,回歸性分析DNA甲基化與鼻咽癌紫杉醇的耐藥相關(guān)性。采用NimbleGen HG18甲基化芯片和Affymetrix HG-U133Plus2.0基因表達(dá)譜芯片分別分析鼻咽癌耐藥細(xì)胞的甲基化譜和基因表達(dá)譜系,并結(jié)合DNA甲基化芯片和基因表達(dá)譜芯片結(jié)果分析鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因。篩選出來(lái)的候選基因通過(guò)在線生物分析軟件進(jìn)行GO功能分類和KEGG信號(hào)通路分析,同時(shí)進(jìn)一步通過(guò)甲基化特異性PCR(MS-PCR)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：鼻咽癌耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol均呈整體高甲基化狀態(tài),并隨腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性的增強(qiáng)其甲基化水平增高。進(jìn)一步回歸性分析顯示DNA甲基化與紫杉醇耐藥性呈正相關(guān)。三個(gè)耐藥細(xì)胞系中DNA甲基化芯片篩選出117個(gè)甲基化共同差異基因,其中高甲基化基因83個(gè)(70.94%),低甲基化基因34個(gè)(29.04%)。表達(dá)譜芯片篩選三個(gè)耐藥細(xì)胞系中共同表達(dá)差異的基因有327個(gè),其中表達(dá)上調(diào)基因129個(gè)(39.45%),表達(dá)下調(diào)基因198個(gè)(60.55%)。結(jié)合兩種芯片結(jié)果篩選,獲得具有甲基化差異并且表達(dá)顯著改變的基因有48個(gè)。其中高甲基化、表達(dá)下調(diào)基因13個(gè),低甲基化、表達(dá)上調(diào)基因14個(gè)。MS-PCR和Real-time PCR驗(yàn)證篩選的6個(gè)候選基因(CHFR、 PEG10、 ABCC5、CDKN1C、DLC1及ERBB2),結(jié)果與甲基化芯片以及表達(dá)譜芯片一致。 結(jié)論：DNA甲基化與鼻咽癌紫杉醇耐藥形成密切相關(guān),DNA異常甲基化后的耐藥相關(guān)基因表達(dá)改變導(dǎo)致腫瘤耐藥的形成。DNA甲基化芯片聯(lián)合基因表達(dá)譜芯片分析鼻咽癌紫杉醇耐藥的方法能夠有效、特異性地篩選耐藥相關(guān)基因,是研究腫瘤耐藥的一種非常好的手段。篩選出的候選基因通過(guò)功能分類和信號(hào)通路分析,被證明大部分參與了腫瘤耐藥形成機(jī)制。CHFR、PEG10、ABCC5、GSTP1、DLC1及ERBB2經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,可能成為特異的腫瘤耐藥標(biāo)志。 第二章5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥性研究 目的：觀察5-aza-dC對(duì)鼻咽癌親本細(xì)胞系(CNE-1、HNE-2和5-8F)和耐藥細(xì)胞系(CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol)的生長(zhǎng)抑制作用,并比較其差異。初步研究5-aza-dC對(duì)鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞耐藥性的影響。 方法：集落形成試驗(yàn)檢測(cè)5-aza-dC單藥及5-aza-dC聯(lián)合紫杉醇干預(yù)鼻咽癌親本和耐藥細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖的影響,并觀察5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥性的作用。運(yùn)用Hochest染色法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：不同濃度梯度的5-aza-dC(0uM、1uM、2uM、5uM、10uM、15uM、20uM、25uM、30uM)對(duì)鼻咽癌親本和耐藥細(xì)胞增殖均有抑制作用,測(cè)得親本細(xì)胞CNE-1、HNE-2和5-8F的IC50值分別為：9.7±0.2uM、10.5±0.6uM、11.2±0.5uM；耐藥細(xì)胞系CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol的IC50值分別為：4.9±0.3uM、5.3±0.2uM、6.1±0.3uM。結(jié)果顯示5-aza-dC對(duì)紫杉醇耐藥細(xì)胞系的抑制作用明顯高于親本細(xì)胞(p0.01)。5uM5-aza-dC預(yù)處理后紫杉醇對(duì)CNE-1/taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol生長(zhǎng)抑制的IC50值分別為4.87±0.29nM、5.35±0.24、5.79±0.34,耐藥指數(shù)分別為3.43±0.11、3.86±0.13、4.53±0.17其敏感性顯著增加(p0.01),而親本細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性無(wú)明顯變化(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-aza-dC處理的鼻咽癌耐藥細(xì)胞,G0/G1期比例增加,凋亡比例增高,且顯著高于親本細(xì)胞系(P0.05)。 結(jié)論：5-aza-dC對(duì)鼻咽癌親本及紫杉醇耐藥細(xì)胞增殖均有抑制作用,紫杉醇耐藥細(xì)胞對(duì)具有更高的敏感性。5-aza-dC處理后耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的敏感性明顯增加,從而可以部分逆轉(zhuǎn)鼻咽癌對(duì)紫杉醇的化療耐藥。 第三章5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥機(jī)制研究 目的：初步探討篩選出的候選基因CHFR、PEG10、ABCC5、GSTP1、 DLC1及ERBB2在鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)中的作用。 方法：MS-PCR檢測(cè)5-aza-dC作用對(duì)候選基因甲基化狀態(tài)的影響。并通過(guò)Real-time PCR和western blot,在mRNA及蛋白質(zhì)水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)觀察不同劑量5-aza-dC和紫杉醇處理對(duì)耐藥細(xì)胞基因的表達(dá)影響。 結(jié)果：5-aza-dC對(duì)高甲基化基因CHFR、PEG10及DLCl具有去甲基化作用,但對(duì)低甲基化基因ABCC5、GSTP1及ERBB2甲基化狀態(tài)無(wú)明顯影響。鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞表達(dá)下調(diào)基因CHFR、PEGIODLC1經(jīng)不同濃度5-aza-dC處理后mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)(p0.01),而低甲基化基因ABCC5, GSTPl及ERBB2表達(dá)無(wú)明顯改變(P0.05)。但5-aza-dC對(duì)CHFR、PEG10、DLC1的表達(dá)改變?cè)诘蛣┝亢透邉┝拷M之間比較無(wú)顯著差異。 結(jié)論：CHFR、PEG10、DLC1異常高甲基化可能參與了鼻咽癌紫杉醇耐藥形成過(guò)程。5-aza-dC可能通過(guò)改變CHFR、PEG10、DLC1基因的甲基化使沉默基因重新表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 李文歡,崔屹,朱菊人;甲基化寡核苷酸抑制MRP_2表達(dá)逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞HepG2多藥耐藥的研究[J];癌癥;2004年08期

2 黃錦;林菊生;董旭e，

本文編號(hào)：2379740