【摘要】：第一部分喉鱗癌microRNA表達譜變化及候選靶基因分析 背景：microRNA(微小RNA,簡稱miRNA)是一種非編碼RNA,在惡性腫瘤的基因表達轉錄后調節(jié)中發(fā)揮作用。本部分研究miRNA在喉鱗癌組織中表達譜變化,為LSCC研究提供了新的方向。 方法：通過激光顯微切割技術(LCM)分離6例喉癌組織腫瘤細胞,采用miRNA芯片篩查喉癌組織與癌旁正常組織中miRNA表達譜變化,在48對喉癌組織及癌旁正常組織中,采用實時定量PCR技術驗證miRNA芯片結果,通過生物信息學軟件預測這些差異表達miRNAs的靶基因,在24對喉癌組織中檢測候選基因的表達水平。 結果：通過miRNA芯片檢測,篩查得到29個差異表達的miRNAs,經過實時定量PCR驗證后,有6個被證實包括表達上調的miR-21、miR-93、miR-205和miR-708,表達下調的miR-125b和miR-145。使用軟件預測共有25個候選靶基因,經檢測后有10個候選基因在LSCC中表達水平有差異。 結論：這些差異表達的miRNA在喉癌的發(fā)生和演進過程中可能發(fā)揮了重要作用,并且為miRNA的功能研究提供了方向。 第二部分miR-125b通過EIF2C2抑制喉癌Hep-2細胞增殖 背景：失控的自主性增殖是惡性腫瘤細胞具有的主要特征之一,細胞周期控制紊亂導致腫瘤細胞增殖調控異常。本部分在體外和體內水平研究上調miR-125b對喉癌Hep-2細胞增殖的影響及機制。 方法：采用慢病毒載體構建miR-125b表達載體,感染Hep-2細胞后建立能夠穩(wěn)定高表達miR-125b的穩(wěn)轉細胞株Hep-2-miR-125b和對照細胞株Hep-2-vector,WST-1實驗檢測細胞增殖能力,流式細胞術檢測細胞周期和凋亡變化。并將Hep-2-miR-125b和Hep-2-vector細胞接種NOD/SCID小鼠,觀察小鼠移植瘤生長情況。采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)初步驗證EIF2C2(eukaryotic translation initiation factor2C-2,真核轉錄起始因子2C-2)是miR-125b的靶基因,在兩株細胞中檢測候選基因EIF2C2mRNA表達和蛋白水平變化。 結果：Hep-2-miR-125b能夠穩(wěn)定、高水平表達miR-125b,miR-125b過表達后能夠抑制Hep-2細胞的增殖能力,抑制NOD/SCID小鼠體內成瘤能力,使Hep-2細胞停滯于G0-G1期,凋亡沒有變化。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)顯示miR-125b能夠抑制EIF2C2載體40%的熒光素酶活性,驗證EIF2C2是miR-125b的靶基因,并在mRNA水平和蛋白水平上進一步證實miR-125b可以抑制EIF2C2的表達。 結論：上調miR-125b通過靶向EIF2C2抑制喉癌Hep-2細胞增殖,本研究為以miR-125b作為靶點治療喉癌提供了一定的理論依據。
[Abstract]:Part I changes of microRNA expression profile and candidate target gene analysis in laryngeal squamous cell carcinoma background: microRNA (minimal RNA, (miRNA) is a non-coding RNA, that plays a role in the posttranscriptional regulation of gene expression in malignant tumors. In this part, we study the changes of miRNA expression profile in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC), and provide a new direction for the study of LSCC. Methods: six cases of laryngeal carcinoma tumor cells were isolated by laser microdissection technique (LCM). The miRNA expression patterns were screened by miRNA microarray in 48 pairs of laryngeal cancer tissues and adjacent normal tissues. Real-time quantitative PCR was used to verify the results of miRNA microarray. The target genes of these differentially expressed miRNAs were predicted by bioinformatics software. The expression level of candidate genes was detected in 24 pairs of laryngeal carcinoma tissues. Results: by miRNA chip analysis, 29 differentially expressed miRNAs, were screened after real-time quantitative PCR verification, and 6 of them were confirmed to include up-regulated miR-21,miR-93,miR-205 and down-regulated miR-125b and miR-145.. A total of 25 candidate target genes were predicted by software, and 10 candidate genes were detected with different expression levels in LSCC. Conclusion: these differentially expressed miRNA may play an important role in the development and progression of laryngeal carcinoma and provide a direction for the study of the function of miRNA. The second part: miR-125b inhibits the proliferation of laryngeal carcinoma Hep-2 cells through EIF2C2: uncontrolled autonomous proliferation is one of the main characteristics of malignant tumor cells. The disorder of cell cycle control leads to abnormal regulation of tumor cell proliferation. The effect and mechanism of upregulation of miR-125b on the proliferation of laryngeal carcinoma Hep-2 cells were studied in vitro and in vivo. Methods: miR-125b expression vector was constructed by using lentivirus vector. After infection with Hep-2 cells, stable and highly expressed miR-125b cell line Hep-2-miR-125b and control cell line Hep-2-vector, were established. WST-1 assay was used to detect cell proliferation and flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis. Hep-2-miR-125b and Hep-2-vector cells were inoculated into NOD/SCID mice to observe the growth of transplanted tumor. Double luciferase reporter gene detection system was used to preliminarily verify that EIF2C2 (eukaryotic translation initiation factor2C-2, eukaryotic transcription initiation factor (2C-2) is the target gene of miR-125b. The expression of candidate gene EIF2C2mRNA and the change of protein level were detected in two cell lines. Results: Hep-2-miR-125b could be stable, and high level expression of miR-125b,miR-125b could inhibit the proliferation of Hep-2 cells, inhibit the tumorigenic ability of NOD/SCID mice, and make Hep-2 cells stop at G0-G1 phase. Apoptosis did not change. Double luciferase reporter gene detection system showed that miR-125b could inhibit 40% luciferase activity of EIF2C2 vector, which confirmed that EIF2C2 was the target gene of miR-125b. It was further confirmed that miR-125b could inhibit the expression of EIF2C2 at mRNA level and protein level. Conclusion: upregulation of miR-125b inhibits the proliferation of laryngeal carcinoma Hep-2 cells through targeted EIF2C2. This study provides a theoretical basis for the treatment of laryngeal carcinoma with miR-125b as the target.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.65

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本文編號：2329402