【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)為臨床上比較常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病,是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的五大疾病之一。伴隨當(dāng)代經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展以及生活水平的提高,DM的發(fā)生率正在呈快速上升趨勢(shì),預(yù)計(jì)2025年將增長(zhǎng)至3.5億人。糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是DM最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,已經(jīng)成為DM患者視力減弱乃至失明的重要原因,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此深入探索DR的發(fā)病機(jī)制,為臨床尋找新的方法治療DR具有重大意義。有文獻(xiàn)報(bào)道,鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中出現(xiàn)大量空泡樣變,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)胞體腫脹,數(shù)目顯著減少,并發(fā)生明顯凋亡。同時(shí)越來(lái)越多的研究證實(shí),在DM早期出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞病變,并伴隨RGCs損傷、凋亡、結(jié)構(gòu)改變及功能狀態(tài)減退。眾所周知,RGCs是唯一的視覺(jué)輸出細(xì)胞,且RGCs軸突是視神經(jīng)的重要組成部分,因此RGCs受損、凋亡及再生修復(fù)是DR發(fā)病及視力減退的重要機(jī)制之一。盡管國(guó)內(nèi)外目前對(duì)糖尿病RGCs已經(jīng)展開了大量研究,但RGCs損傷、凋亡、再生受抑的原因及具體分子機(jī)制并未完全明確,仍需進(jìn)一步探索。近年研究發(fā)現(xiàn),軸突生長(zhǎng)抑制因子蛋白受體(Nogo receptor,Ng R)在視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷、修復(fù)及再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。將其干擾后能有效恢復(fù)大鼠RGCs細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。本課題組前期工作表明,DR病理?xiàng)l件下,視網(wǎng)膜組織中Ng R及Rock1蛋白表達(dá)明均顯上調(diào),提示Ng R-Rho A-Rock1信號(hào)通路在DR狀態(tài)下被激活。此外,Rho A/Rock信號(hào)通路激活后作用于細(xì)胞骨架蛋白(F-actin),進(jìn)而抑制軸突末端生長(zhǎng)錐的延伸及神經(jīng)節(jié)再生。而將該信號(hào)上游蛋白Ng R抑制后可以恢復(fù)視網(wǎng)膜受損后的軸突再生功能,抑制RGCs凋亡。表明Ng R-Rho ARock1信號(hào)通路亦很可能參與調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損、凋亡及再生過(guò)程。睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一種多效神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,可以滋養(yǎng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。視網(wǎng)膜局部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏難以維持RGCs生存,是導(dǎo)致DR患者視力下降的又一重要因素。有研究證實(shí)CNTF對(duì)外傷性視神經(jīng)損傷RGCs具有明顯保護(hù)作用,而外源性給予CNTF可明顯保護(hù)遺傳性糖尿病小鼠及Ⅰ型糖尿病大鼠的視力。提示,CNTF在視神經(jīng)修復(fù)、軸突再生及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中扮演重要角色,但其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響及調(diào)控機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外仍知之甚少。綜上,本課題擬通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究si Ng R及CNTF對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生存及再生的影響,并探討兩者是否存在協(xié)同作用以及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制。期望能為DR臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及新型治療方案。第一部分Ng R干擾及CNTF預(yù)處理對(duì)高糖誘導(dǎo)的RGC-5凋亡的影響目的:明確si Ng R及CNTF對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠RGC-5增殖、損傷及凋亡的影響。方法:RGC-5轉(zhuǎn)染si Ng R或給予CNTF預(yù)處理,高糖誘導(dǎo)建立細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、高糖組、高糖+NC組、高糖+si Ng R組、高糖+CNTF組、高糖+CNTF+si Ng R組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖變化,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況,Real-time PCR及Western blot檢測(cè)Ng R及其下游Rho A、Rock1 m RNA和蛋白的表達(dá),免疫熒光技術(shù)對(duì)RGCs特異性標(biāo)志物及突起長(zhǎng)度進(jìn)行定量分析。結(jié)果:MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,高糖導(dǎo)致RGC-5細(xì)胞增殖能力顯著降低,凋亡數(shù)量明顯增加(P0.01),而si Ng R轉(zhuǎn)染或CNTF預(yù)處理后RGC-5細(xì)胞的增殖能力顯著提高,凋亡數(shù)量明顯減少(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用;Real-time PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Ng R、Rho A及Rock1 m RNA及蛋白在細(xì)胞模型中的表達(dá)顯著增加(P0.01),而si Ng R轉(zhuǎn)染或CNTF預(yù)處理后三者表達(dá)水平均顯著下降(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)高糖誘導(dǎo)后RGCs細(xì)胞突起變短,標(biāo)志物表達(dá)水平顯著下降(P0.01),而si Ng R轉(zhuǎn)染或CNTF可以提高標(biāo)志物的表達(dá),增加細(xì)胞突起長(zhǎng)度,且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用。結(jié)論:Ng R干擾或外源性給予CNTF可以協(xié)同保護(hù)RGC-5,促進(jìn)受損細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡,且同Ng R-Rho A-Rock1信號(hào)通路密切相關(guān)。第二部分si Ng R及CNTF對(duì)糖尿病大鼠RGCs凋亡及再生的影響目的:明確玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF對(duì)糖尿病大鼠RGCs凋亡及再生的影響。方法:腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,成功誘導(dǎo)后玻璃體內(nèi)局部注射si Ng R或CNTF進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、糖尿病組、糖尿病+NC組、糖尿病+si Ng R組、糖尿病+CNTF組,糖尿病+CNTF+si Ng R組。12周后取各組大鼠視網(wǎng)膜組織,采用HE染色觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài),TUNEL法分析RGCs凋亡率,Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡及軸突再生相關(guān)蛋白的表達(dá),Real-time PCR及免疫組化技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證軸突再生標(biāo)志物m RNA及蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果:HE染色及TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示,糖尿病大鼠RGCs層空泡化,數(shù)量明顯減少,凋亡率顯著上升(P0.01),而玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF后RGCs數(shù)量明顯增加,凋亡率顯著下降(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、caspase-3的表達(dá)顯著增加,Bcl-2及F-actin、GAP-43的表達(dá)明顯減少(P0.01),而玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF可以明顯逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的表達(dá),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用;Real-time PCR及免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了si Ng R或CNTF可以顯著增加軸突再生標(biāo)志物Factin、GAP-43 m RNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)論:si Ng R和CNTF可以協(xié)同促進(jìn)糖尿病大鼠RGCs存活,誘導(dǎo)軸突再生,抑制細(xì)胞凋亡。第三部分si Ng R及CNTF影響糖尿病RGCs凋亡及再生的分子機(jī)制目的:明確si Ng R或CNTF對(duì)糖尿病大鼠RGCs的影響是否同Ng RRho A-Rock1信號(hào)通路有關(guān)。方法:腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,藥物治療及實(shí)驗(yàn)分組同第二章。16周后收集各組大鼠視網(wǎng)膜組織,采用Real-time PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)Ng R、Rho A、Rock1 m RNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果:Real-time PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中Ng R、Rho A、Rock1 m RNA及蛋白的表達(dá)顯著增加(P0.01),而玻璃體內(nèi)注射si Ng R或CNTF后三個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平均顯著下降(P0.01),且si Ng R與CNTF存在協(xié)同作用。結(jié)論:si Ng R和CNTF可以協(xié)同抑制Ng R-Rho A-Rock1信號(hào)通路激活,誘導(dǎo)RGCs再生,抑制細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R774.1;R587.2

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本文編號(hào)：2289384