發(fā)布時間：2018-03-16 15:47

  本文選題：ROP　切入點：高通量測序　出處：《東南大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與意義：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity,ROP)是主要發(fā)生于早產(chǎn),低出生體重兒的一種可致盲的血管增殖視網(wǎng)膜病,也是世界范圍內(nèi)兒童致盲的主要因素。視網(wǎng)膜新生血管的形成是ROP的主要病理變化,研究已經(jīng)證實血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最強的促血管生成因子,在ROP的發(fā)生發(fā)展中其表達水平的會發(fā)生顯著的變化,因此深入探討研究這些導致視網(wǎng)膜新生血管生成的因子及其調(diào)控分子的表達變化對于ROP的研究具有十分重要意義。近年來,microRNA (miRNA)是一類非編碼的小RNA,自被發(fā)現(xiàn)以后就成為了生物醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點。研究結(jié)果表明miRNA作為一種重要的調(diào)控分子已經(jīng)被證實在人類許多疾病的研究中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。特別最近發(fā)現(xiàn)的同樣具有重要價值的存在于外周血液中的循環(huán)miRNA的表達情況更是受到了臨床研究者的重視。因此尋找能夠在視網(wǎng)膜血管新生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的調(diào)控小分子miRNA及其相關(guān)靶基因是ROP進一步深入研究的重要途徑。高通量DNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展為相關(guān)調(diào)節(jié)分子的大規(guī)�？焖俸Y選提供了可靠的手段,新一代高通量測序技術(shù)亦被用于本論文研究中。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率雖然很高,但是從早產(chǎn)兒身上收集足夠量以及合適的分析樣本確實非常困難的事情。因此實驗動物的研究是ROP相關(guān)疾病研究的必經(jīng)之路,ROP新生大鼠/小鼠模型的構(gòu)建方案已經(jīng)比較成熟,本研究也不例外的應用模型大鼠來進行相關(guān)的實驗與分析。ROP的致病因素很是復雜,至今也沒有完全研究清楚,但是早產(chǎn)兒吸氧已被證實是導致視網(wǎng)膜血管新生的主要因素,從而成為ROP的主要的致病原因之一,因此本論文研究的主要實驗對象即為高氧誘導的ROP模型SD大鼠。綜述所示,本論文研究擬利用高通量測序手段系統(tǒng)全面的分析高氧誘導的ROP模型SD大鼠血漿樣本以及視網(wǎng)膜組織中miRNA的差異表達情況,隨后通過驗證及其調(diào)控靶目標表達水平的檢測分析,探索導致ROP產(chǎn)生的深層次的分子機制以及對ROP診斷治療具有潛在價值的生物分子進行系統(tǒng)的評估。論文研究的主要成果如下：方法與結(jié)果1)ROP模型SD大鼠的構(gòu)建及其血漿循環(huán)miRNA的高通量測序篩選論文研究首先選擇新生SD大鼠進行高氧環(huán)境刺激,構(gòu)建ROP模型,然后通過視網(wǎng)膜血管形態(tài)及增生情況進行模型動物構(gòu)建成功與否的評價；隨后收集模型組和對照組外周血液樣本,分離血漿,制備模型組和對照組pool樣本,提取RNA,質(zhì)控后進行文庫構(gòu)建和Illumina HiSeq 2500的高通量測序。實驗結(jié)果顯示：1)本研究中構(gòu)建的ROP模型SD大鼠視網(wǎng)膜病變特征明顯,顯示視網(wǎng)膜血管發(fā)育滯緩,管徑變細,分支減少而且有明顯擴張迂曲,大量新生血管形成,血管密度增高,HE染色切片有很多的突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核,ROP模型鼠構(gòu)建成功；2)高通量miRNA測序結(jié)果顯示在模型鼠與對照鼠血漿中存在一些具有顯著性差異表達的miRNA,經(jīng)過嚴格的篩選共獲得上調(diào)的miRNA22種,下調(diào)的miRNA44種,所有后續(xù)深入研究涉及的miRNA將主要來源于此。此外在測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)存在5p和3p共表達的miRNA中,其表達水平的比值亦存在一定的規(guī)律性,ROP模型組與對照組之間5p/3p的比值存在一定的差異,提示其具有進一步研究的潛在價值。2)ROP模型鼠視網(wǎng)膜組織miRNA的高通量篩選為了更加全面的了解循環(huán)miRNA與特定疾病的關(guān)系,模型鼠視網(wǎng)膜組織也被同時收集起來并提取RNA,進行了高通量芯片篩選與生物信息分析,以期與血漿中循環(huán)miRNA的表達情況進行對比分析,更為確切地尋找ROP特異性的miRNA分子。芯片檢測結(jié)果顯示ROP模型組與對照組之間存在一些差異表達的niRNA,進一步嚴格其篩選條件后獲得了13種上調(diào)的]miRNA和14種下調(diào)的miRNA,這些miRNA的靶基因功能富集顯示其可能與對低氧的反應等相關(guān)的GO功能及調(diào)控通路有關(guān),為進一步分析研究血漿中miRNA的差異表達情況提供了重要的參考。3)循環(huán)niRNA差異表達情況的分析、驗證與部分相關(guān)基因功能的研究差異表達miRNA的篩選不是最終目標,其確切的功能及其在ROP中可能的作用機制才是論文研究的主要目標,因此初步篩序獲得的循環(huán)miRNA進行了進一步的生物信息分析,包括靶基因預測,GO功能富集和KEGG調(diào)控通路分析。針對前期測序和后續(xù)生物信息分析的結(jié)果,部分差異表達的miRNA進行了定量PCR的驗證；同時檢測了相關(guān)的靶基因在模型組和對照組之間的mRNA和蛋白水平的表達差異。還針對個別靶基因VEGF和GABA與miRNA的關(guān)聯(lián)進行了深入的分析與探討,VEGF與 GABA均已被證實與ROP發(fā)生發(fā)展過程中缺氧環(huán)境有關(guān)。最后通過比較分析視網(wǎng)膜組織和循環(huán)miRNA的差異表達情況,篩選出來4種具有共表達趨勢的miRNA,并且在早產(chǎn)兒病例中進行了定量PCR驗證分析。本部分研究結(jié)果如下：1)篩選出其中10種包含有高豐度表達、低豐度表達、高差異倍數(shù)、低差異倍數(shù)以及上調(diào)和下調(diào)的miRNA的表達情況都在定量PCR的驗證結(jié)果中得到了證實,三種miRNA 5p/3p的比值也在對應的分析中發(fā)現(xiàn)與測序結(jié)果一致；2)生物信息分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過嚴格條件篩選的14種miRNA利用兩種靶基因數(shù)據(jù)庫預測能夠獲得594種共同的靶基因,對這些靶基因進行GO功能富集和KEGG分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)都參與胚胎發(fā)育、細胞的形態(tài)變化、細胞移行、細胞的運動、細胞生物合成等且于血管新生密切相關(guān)的過程,同時還參與了細胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子以及MAPK和TGF-β的信號調(diào)節(jié)通路的正向調(diào)控,細胞間的細胞傳遞等；3)血漿VEGF和血漿GABA的水平分析發(fā)現(xiàn),miRNA參與了這些關(guān)鍵的靶基因的表達調(diào)控,而且它們之間存在著相互協(xié)調(diào)、相互制衡的復雜關(guān)系,其中諸如miR-351、miR-200b等就共同靶向VEGF與GABA,提示這些miRNA可以作為潛在的ROP的治療靶點進行進一步的深入研究和探索；4)視網(wǎng)膜組織與血漿共表達的niRNA在3例早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中得到了證實,在另外兩例中發(fā)現(xiàn)了一些不一致現(xiàn)象,其中一例伴有先天性心臟病,因此提示這些差異表的miRNA可能還同時參與了先天性心臟病等相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)控制。結(jié)論：綜上所述,本論文研究利用高通量測序手段獲得了一些差異表達的miRNA,部分miRNA在定量PCR中獲得了證實；這些miRNA參與調(diào)控的與ROP密切相關(guān)的靶基因的表達情況也在論文中進行了研究與探討；與視網(wǎng)膜組織相比較發(fā)現(xiàn)了一些共表達的miRNA,這些miRNA在幾個典型的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變病例中得到了驗證。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1;R-332

【參考文獻】

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本文編號：1620589