本文關鍵詞： Egr-1 5-FU hTERTC27 鼻咽癌 TCF3 胚胎癌 Oct4　出處：《吉林大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：1Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU治療鼻咽癌的實驗研究 研究背景 鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是一種發(fā)生于鼻咽部粘膜的惡性腫瘤。多發(fā)區(qū)主要在中國的廣東、廣西、福建等地。發(fā)病年齡范圍較廣，主要為中年人，也有青少年患病者。鼻咽癌惡性程度很高，常常伴有局部淋巴結轉移或遠處轉移。發(fā)病因素較為復雜，包括遺傳因素、EB病毒因素和環(huán)境致癌因素。目前鼻咽癌的治療主要以局部放射治療和化學療法為主。但是，對于晚期鼻咽癌和早期切除但預后不良的鼻咽癌患者，目前仍然沒有有效的治療方式。因此，尋找一種新的治療方式迫在眉睫。 5-氟尿嘧啶（5-Fluroracil，5-FU）是一種常用的治療鼻咽癌的化療藥物，它是尿嘧啶5位上的氫被氟取代的一種衍生物，能夠抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，干擾DNA和蛋白質的合成。然而，5-FU毒性作用較大，患者常常因為耐受不了高劑量5-FU引起的不良反應而被迫終止治療。因此，尋求新型的生物治療方式來聯(lián)合殺傷腫瘤細胞，協(xié)同減低化療藥物的使用劑量，提高患者的耐受能力，增強腫瘤化療的治療效果是目前急需解決的問題之一。 早期生長反應基因1(early growth response gene，Egr-1)啟動子中有6個CArG[CC(A+T-rich)6GG]血清反應元件，在電離輻射或化學藥物的誘導下可以被激活，從而啟動下游基因的表達，這種作用是通過ROIs（reactive oxygen intermediates，ROIS）介導的�？茖W家利用Egr-1啟動子作為橋梁，提出了腫瘤的基因-化學治療設想。將同時具有誘導特性的Egr-1啟動子和腫瘤殺傷基因或是免疫治療基因轉入體內，在對腫瘤進行化療的同時誘導目的基因的高表達，從而達到化學治療和基因治療的雙重腫瘤殺傷作用，降低等效化療藥物的治療劑量，緩解正常組織的損傷，降低毒副作用，提高治療效果。利用Egr-1啟動子的橋梁作用，聯(lián)合治療基因如CD、TK、CDglyTK、endostatin等治療胃腸道癌、腦神經膠質瘤、肝癌等惡性腫瘤已取得了令人矚目的成績。 端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的一個催化亞單位，對于保持端粒長度和延長細胞壽命具有重要作用。端粒酶逆轉錄酶在大多數(shù)腫瘤細胞中高表達，而在正常細胞中幾乎很少表達。因此，端粒酶逆轉錄酶可作為比較理想的腫瘤檢測診斷的標志和腫瘤基因治療的靶點。hTERTC27，是人端粒酶逆轉錄酶C-末端一個27kDa的多肽，該片段保留了端粒酶RNA結合域而去除了逆轉錄結構域，2002年香港大學Huang JJ與Lin MC教授利用基因重組技術構建了hTERTC27多肽片段。體外實驗研究證實在人宮頸癌HeLa細胞中過表達hTERTC27可以引起端粒的功能異常，促使染色體末端快速融合，并且增強細胞對過氧化氫（H2O2）誘導的氧化應激反應。此外，hTERTC27過表達可以誘導HeLa細胞出現(xiàn)凋亡和老化，對于接種HeLa細胞的宮頸癌裸鼠模型也具有明顯的抑瘤效果。除了HeLa之外，進一步研究表明腺病毒載體裝載的hTERTC27多肽片段對于接種U87-MG人腦膠質細胞瘤的裸鼠模型也產生了同樣明顯的抑瘤效果。因此，hTERTC27做為新型構建的抗腫瘤多肽，具有良好的應用前景。但是，hTERTC27是否對人鼻咽癌C666具有抗腫瘤效應，目前國內外尚未見相關研究報道。 本研究以Egr-1啟動子作為橋梁，將hTERTC27片段構建在Egr-1啟動子下游，通過5-FU誘導hTERTC27高表達。觀察5-FU誘導Egr-1啟動子驅動的hTERTC27（簡稱Egr-hTERTC27）聯(lián)合5-FU對鼻咽癌的體內外抑瘤效應，并初步探討其作用機制。本研究首次以Egr-1啟動子作為橋梁，以5-FU作為誘導劑，將hTERTC27片段聯(lián)合5-FU對鼻咽癌進行基因-化療雙重治療，為鼻咽癌腫瘤治療提供一種新的治療方案。 方法 采用脂質體轉染法建立穩(wěn)定細胞株，采用熒光顯微鏡、流式細胞術和Western blot方法觀察5-FU對Egr-1啟動子的誘導效應。采用MTT法、細胞克隆形成實驗、AnnexinV/PI雙染法結合流式細胞術，以及Tunel技術觀察Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU對鼻咽癌C666-1細胞的體外協(xié)同抑瘤效應。采用穩(wěn)定細胞株建立鼻咽癌皮下移植瘤模型，通過腫瘤生長曲線、瘤重和HE染色觀察二者體內協(xié)同抑瘤效應。采用Western blot分析觀察凋亡激活相關蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9的表達以及Bcl-2抑凋亡蛋白的表達。 結果 體外實驗結果表明，5-FU可以成功誘導Egr-1啟動子下游目的基因hTERTC27的高表達，5-FU誘導后的hTERTC27蛋白表達較對照組最多可增加7倍左右。過表達的hTERTC27能夠提高鼻咽癌C666-1細胞對5-FU的敏感性，并且進一步抑制細胞增殖達20%。Egr-hTERTC27(Egr-1啟動子誘導過表達的hTERTC27)聯(lián)合5-FU可以協(xié)同抑制細胞增殖以及促進細胞凋亡，聯(lián)合治療組的細胞凋亡率是hTERTC27單獨治療組的 4.8倍，是5-FU單獨治療組的1.8倍。體內實驗結果表明，Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU協(xié)同地抑制腫瘤生長速度、腫瘤重量，并且降低腫瘤的局部浸潤。此外，聯(lián)合治療組凋亡激活相關蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9蛋白表達增加，抑凋亡Bcl-2蛋白表達減少。 結論 Egr-1啟動子介導的hTERTC27過表達(Egr-hTERTC27)聯(lián)合化療藥物5-FU能夠協(xié)同抑制鼻咽癌的生長并促進其凋亡，對鼻咽癌具有很好的治療效果。這些結果提示我們，Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU可能作為鼻咽癌治療的一種新途徑。 2TCF3抑制小鼠胚胎癌生長的實驗研究 研究背景 胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ES細胞）來源于囊胚發(fā)育的內層細胞團（InnerCell Mass），是一種高度未分化的干細胞。ES細胞可以自我更新、無限增殖并且具有多分化潛能，能夠分化成體內所有組織和器官。ES細胞的發(fā)現(xiàn)為生物發(fā)育調控的研究以及組織生物學工程的研究帶來深遠的影響。但是由于ES細胞研究受到倫理和道德的 約束，很大程度上限制ES細胞的研究。 胚胎癌(Embryonic carcinoma，EC)細胞是一種高度惡性的腫瘤細胞，是一種來源于惡性畸胎瘤的干細胞。它既屬于一種腫瘤干細胞，又與ES細胞類似，具有相近的組織學起源以及生物學特性。由于EC細胞與腫瘤干細胞以及ES細胞之間存在許多相似性，EC細胞越來越受到廣大干細胞研究者的青睞。ES細胞的調控機制錯綜復雜，其具體機制尚不清楚晰，進一步探索EC細胞的調控機制，對于正確理解EC及ES細胞的發(fā)育生物學特性及其應用具有重要的意義。 Wnt信號通路途徑在ES細胞中扮演重要角色，它可以調節(jié)多種ES細胞的自我更新能力和分化潛能。它能夠調節(jié)Oct-3/4、Nanog等重要干性基因的表達，調節(jié)ES細 胞在皮膚、神經系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的命運決定。此外，Wnt能夠上調BMP家族蛋白的表達，抑制ES細胞向神經的分化等。T細胞因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）家族蛋白是Wnt家族蛋白最終的效應分子，它具有一個保守的HMG結構域和與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）相互作用的結構域。Wnt信號途徑的活化促使β-連環(huán)蛋白在細胞質中積累，并且進入細胞核，與TCF/LEF家族蛋白相互作用，進一步調節(jié)靶基因如c-Myc、Cyclin D1等的表達。TCF/LEF是一類具有雙向調節(jié)功能的轉錄因子。一方面，它可以和CtBP以及Groucho蛋白結合從而抑制基因轉錄。另一方面，它可以結合β-catenin從而促進基因轉錄。 TCF家族蛋白有四種，，包括TCF1-4，其中TCF3在ES細胞中表達含量最高。最近研究表明TCF3在ES細胞中可以和TLE2形成抑制復合物，共定位在干性基因Oct4，Nanog的啟動子上，是Oct4和Nanog核心調節(jié)網絡中非常重要的組成部分。TCF3的缺失可以增加Oct4和Nanog等其他ES轉錄因子的表達，并且使ES細胞具有抵抗分化的潛能。正常情況下，體外培養(yǎng)的小鼠ES細胞需要在外源性白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF)的作用下才能保持自我更新的能力，將TCF3去除可以使小鼠ES細胞在沒有LIF的條件下也可以進行自我更新，并且在分化刺激條件下出現(xiàn)分化遲緩。多項研究表明TCF3在維持ES細胞的增殖和自我更新能力中意義重要，但是其在EC細胞中的作用以及具體機制尚不明確。 本研究目的在于觀察TCF3在EC腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用并初步探討其作用機制。本研究首次探討TCF3在EC中的作用，為進一步理解干細胞和EC的調控機制提供了一定的理論依據(jù)。 方法 采用分子克隆技術構建逆轉錄病毒重組載體，利用逆轉錄病毒包裝感染技術建立TCF3穩(wěn)定過表達的F9胚胎癌細胞株。Western blot和RT-PCR分析鑒定穩(wěn)定細胞株的建立。應用TCF3過表達的F9胚胎癌細胞株進行體外研究，細胞計數(shù)法、MTT比色法以及軟瓊脂克隆形成實驗觀察TCF3過表達對F9細胞增殖能力的影響。細胞遷移實驗觀察TCF3過表達對F9細胞遷移能力的影響。采用穩(wěn)定細胞株建立小鼠胚胎癌皮下移植瘤模型，通過腫瘤生長曲線、瘤重、生存率以及HE染色觀察TCF3過表達對胚胎癌生長的影響。采用細胞免疫熒光和Western blot法觀察Oct4在F9細胞中的表達。采用RT-PCR和Western blot分析法觀察TCF3過表達對Oct4基因mRNA轉錄和蛋白表達的影響。采用RNAi技術觀察TCF3干涉沉默后對Oct4表達的影響。 結果 體外實驗結果表明TCF3過表達顯著抑制F9細胞株的增殖、克隆形成和遷移能力，抑制率分別達到約30%、45%和30%。體內小鼠移植瘤模型結果表明TCF3過表達顯著抑制腫瘤體積大小(36.4%)、腫瘤重量(34.8%)、腫瘤惡性程度進程和腫瘤局部浸潤，以及延長了荷瘤小鼠的生存時間。F9胚胎癌中TCF3的過表達能夠下調Oct4蛋白的表達。相反，siRNA干涉TCF3的表達能夠上調Oct4的表達。 結論 TCF3過表達能夠抑制小鼠F9胚胎癌的生長，其機制可能是因為下調Oct4蛋白的表達。本研究所采用的技術路線及實驗結果在國內外均未見報道。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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1 凌春華,季成,陳延斌,傅建新,陳衛(wèi)昌,楊吉成,蘇燎原;內皮抑素基因轉移聯(lián)合電離輻射對肺腺癌移植瘤生長的影響[J];中華結核和呼吸雜志;2004年10期

2 魏道嚴,戴冰冰,陳詩書;放射誘導經Egr-1啟動子調控的腺病毒介導CDglyTK基因的腫瘤靶向表達[J];中華醫(yī)學雜志;2001年16期

3 ;Construction of targeted plasmid vector pcDNA3.1-Egr.1p-p16 and its expression in pancreatic cancer JF305 cells induced by radiation in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2007年31期

本文編號：1494398