本文關鍵詞：乳腺癌腦轉移細胞系靶向肽BRBP1受體的尋找與鑒定

  更多相關文章： 受體 BRBP1-Fc肽體 免疫共沉淀 質譜

【摘要】：乳腺癌(Breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年提高,已成為嚴重威脅女性健康的重大疾病之一。腦轉移是乳腺癌患者致死、致殘的重要原因,大約10-30%的散發(fā)性患者會發(fā)生乳腺癌腦轉移(breast cancer brain metastases, BCBM),用標準療法(standard treatments),包括全腦放射治療(whole brain radiotherapy, WBRT)、立體定向放射治療(stereotactic radiosurgery, SRS)和手術(Surgery),平均中位生存期也只有1年。為此,研究乳腺癌腦轉移的分子機制,闡明腦轉移過程的相關靶標至關重要。我們實驗室前期利用噬菌體展示肽庫篩選技術(Phage display technology)對乳腺癌腦轉移細胞系231-BR進行全細胞消減篩選,成功獲得了與231-BR細胞系特異性結合的多肽BRBP1(專利號：ZL201210538671.4),體內外實驗研究均已證實該肽與乳腺癌腦轉移細胞系呈現(xiàn)出高親和力結合,并且基于BRBP1肽構建的近紅外熒光成像分子探針可用于腦轉移性乳腺癌荷瘤鼠活體近紅外熒光成像,構建的BRBP1-TAT-KLA復合肽可顯著抑制乳腺癌腦轉移灶的生成及生長。臨床乳腺癌組織水平的初步研究也顯示其與乳腺癌患者腋窩淋巴結轉移手術切除標本特異性結合。因此,尋找與BRBP1肽特異結合的受體對深度認識BRBP1肽的功能、拓寬BRBP1肽的應用價值、探索乳腺癌腦轉移機制具有重要意義。本研究課題主要內容包括以下：1.乳腺癌腦轉移細胞系靶向肽體的表達與特異性鑒定利用基因重組技術構建pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP 1真核表達載體,表達BRBPl-Fc肽體,通過Western blotting實驗驗證蛋白表達正確,ELISA、流式細胞術以及競爭結合免疫熒光等實驗證實BRBP1-Fc肽體保留BRBP1肽與231-BR細胞結合特性,為尋找BRBP1肽的受體以及進一步研究BRBP1的生物學功能奠定基礎。2.免疫(共)沉淀方法對BRBP1肽特異性受體的尋找與鑒定目前尋找受體的方法有多種,但是并無普遍適用且保證成功的方法可遵循。本研究采用免疫(共)沉淀的方法尋找BRBP1肽的受體。即利用真核表達的BRBP1-Fc肽體和Protein G磁珠相互作用,合成BRBP1-BIOTIN生物素肽和鏈霉親和素磁珠相互作用,通過免疫(共)沉淀的方法捕獲與之相互作用的蛋白。實驗設計嚴謹?shù)膶φ?借助銀染方法尋找差異性條帶,通過串聯(lián)質譜技術分析具體蛋白分子。差異表達蛋白共有24個,我們首先分析兩次質譜結果共有的Annexin A2分子,通過細胞免疫熒光實驗證實其在231-BR、MDA-MB-231、MCF-7細胞表面的表達情況符合期望受體分布,繼而通過siRNA、免疫共沉淀實驗研究Annexin A2是否和BRBP1肽相互作用。但是目前還沒有明確二者的具體關系,仍有待后續(xù)進一步探究。此外,我們通過生物信息學軟件分析得到3個候選受體分子(SND1、S100A8, AP2B1),需要后期實驗證明。3.基于數(shù)據(jù)庫生物信息學分析篩選BRBP1肽的受體Matthew D. Dun等研究者就乳腺癌腦轉移細胞231-BR和乳腺癌親代細胞MDA-MB-231細胞在protein、nmRNA、miRNA層面的差異做了綜合、系統(tǒng)、全面、前沿的分析。Riesa M. B.等橫向進行了乳腺癌腦轉移細胞(231-BR)、肺轉移細胞(LMD-231)、骨轉移細胞(BMD-231)、腎上腺轉移細胞(ADMD-231)以及乳腺癌親代細胞(MD-231P)的基因芯片技術。通過檢索相關數(shù)據(jù)庫,我們共得到5個在231-BR細胞上調的膜分子,聯(lián)合MCF-7細胞為對照,通過定量PCR技術初步篩選,發(fā)現(xiàn)相較于MDA-MB-231、MCF-7細胞,Moesin分子在231-BR細胞明顯高表達。隨后我們又通過Western blotting、細胞免疫熒光、流式細胞術實驗證實Moesin分子表達情況符合期望受體分布。繼而我們通過siRNA干擾實驗研究Moesin分子和BRBP1肽相互作用情況。目前,我們已通過干擾實驗初步確定二者的配受體關系。本研究的核心內容即為尋找靶向乳腺癌腦轉移細胞系多肽BRBP1的受體。先后采用了免疫(共)沉淀-質譜分析、數(shù)據(jù)庫篩查的方法。通過數(shù)據(jù)庫篩查法所獲得Moesin分子已初步證實和BRBP1肽的相互作用,通過質譜確立的候選分子需要后期進一步實驗鑒定研究。
【關鍵詞】：受體 BRBP1-Fc肽體 免疫共沉淀 質譜
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 主要英文縮寫詞表11-14
• 前言14-16
• 第一章 文獻綜述 乳腺癌腦轉移發(fā)生機制及相關治療的研究進展16-30
• 第二章 乳腺癌腦轉移細胞系靶向肽體的表達與特異性鑒定30-43
• 1. 材料和試劑30-33
• 2. 實驗方法33-38
• 3. 結果38-41
• 4. 討論41-43
• 第三章 免疫(共)沉淀方法對BRBP1肽特異性受體的尋找與鑒定43-67
• 第一節(jié) 免疫(共)沉淀法尋找BRBP1肽特異性結合受體43-53
• 1. 材料和試劑43-45
• 2. 實驗方法45-49
• 3. 結果49-51
• 4. 討論51-53
• 第二節(jié) 質譜技術聯(lián)合生物信息學分析候選受體53-58
• 1. 材料和試劑53
• 2. 實驗方法53-54
• 3 結果54-57
• 4. 討論57-58
• 第三節(jié) BRBP1肽候選受體的驗證58-67
• 1. 材料和試劑58-60
• 2. 實驗方法60-62
• 3. 結果62-65
• 4 討論65-67
• 第四章 基于數(shù)據(jù)庫生物信息學分析篩選BRBP1肽的受體67-79
• 1. 材料和試劑67-68
• 2. 實驗方法68-72
• 3. 結果72-76
• 4. 討論76-79
• 小結與展望79-80
• References80-86
• 作者簡介86
• 碩士期間發(fā)表論文86
• 碩士期間參加的會議86-87
• 致謝87

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本文編號：903019