本文關(guān)鍵詞：低強(qiáng)度振動(dòng)載荷協(xié)同多孔鈦合金對(duì)長(zhǎng)骨骨缺損修復(fù)的作用效果及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨缺損是矯形外科的常見病和難治病,其發(fā)病原因包括疾病、外傷和某些手術(shù)并發(fā)癥。自體骨移植對(duì)于較小的缺損區(qū)域是臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn),但對(duì)于大量的骨缺損病患,患者自身骨量不足,影響預(yù)后。異體骨移植有較大的抗原反應(yīng)和感染風(fēng)險(xiǎn)。骨替代材料一直是骨移植的重要選擇。鈦合金是一種重要的骨移植替代材料。但傳統(tǒng)的鈦合金骨整合效果較差,力學(xué)屬性不理想。近年來,隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展,多孔鈦合金(porou titanium alloy,p Ti)越來越多的被應(yīng)用于臨床,為骨缺損的金屬材料修復(fù)提供了新思路。相比于傳統(tǒng)鈦合金,pTi具有與骨小梁更相近的結(jié)構(gòu)特征,多孔結(jié)構(gòu)本身能為骨骼中的組織液傳輸提供有效的孔隙通道。但是,由于鈦是惰性金屬,pTi只能與骨組織以機(jī)械鉚合的形式結(jié)合,而非穩(wěn)定的化學(xué)鍵結(jié)合方式,因此仍難以實(shí)現(xiàn)早期快速的骨整合,骨缺損修復(fù)的效率和質(zhì)量仍受到限制。低強(qiáng)度全身振動(dòng)載荷(Low-level whole-body vibration,WBV)是一種安全、經(jīng)濟(jì)、非侵入的物理因子作用方式,不同參數(shù)的WBV刺激對(duì)動(dòng)物和人體骨骼具有顯著的調(diào)控作用。國(guó)內(nèi)外的大量實(shí)驗(yàn)研究證明,WBV能夠有效抑制由廢用和絕經(jīng)導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松,減緩骨量流失,提高骨強(qiáng)度,預(yù)防骨折的發(fā)生。而一些臨床研究也證實(shí),WBV能夠顯著提高正常人群和骨質(zhì)疏松患者的全身骨量,調(diào)控機(jī)體的骨轉(zhuǎn)換。同時(shí),諸多臨床前實(shí)驗(yàn)也證實(shí)WBV能夠顯著促進(jìn)骨折愈合。但是,WBV是否能夠提高pTi的骨整合及骨長(zhǎng)入效果,進(jìn)而提高骨缺損修復(fù)效率和修復(fù)質(zhì)量,國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。在本研究中,首先,我們通過體外實(shí)驗(yàn)探索了wbv對(duì)于pti中的成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生物學(xué)行為、成骨活性以及成骨相關(guān)重要基因和蛋白表達(dá)的影響;然后,我們通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)探索wbv協(xié)同pti對(duì)于兔長(zhǎng)骨骨缺損的修復(fù)效果及其潛在的作用機(jī)制。本研究旨在系統(tǒng)揭示wbv對(duì)于pti骨整合和骨再生的影響及其體內(nèi)外作用機(jī)制,從而為骨缺損的修復(fù)提供新思路,同時(shí)還有望降低臨床骨缺損的修復(fù)治療成本,改善骨缺損病患的生活質(zhì)量。本課題的研究不但具有重要的科學(xué)研究參考價(jià)值,還具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。整個(gè)課題主要分為以下兩個(gè)部分:實(shí)驗(yàn)一:wbv對(duì)pti中的兔原代成骨細(xì)胞行為和功能的影響及機(jī)制研究方法:通過cad技術(shù)設(shè)計(jì)出多孔結(jié)構(gòu)的三維模型(12mm×2.5mm圓片,孔隙率約70%,孔隙直徑約1mm),導(dǎo)入3d打印系統(tǒng),通過電子束熔融技術(shù)將ti-6al-4v粉末逐層熔融凝固,制成pti材料,經(jīng)過超聲清洗、高溫高壓滅菌后,作為實(shí)驗(yàn)用pti。提取新西蘭兔原代成骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞,種植于pti內(nèi)部,施加一定時(shí)間的wbv刺激。分別通過mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖,通過dapi染色和電鏡觀察細(xì)胞在pti表面的粘附情況,通過fitc染色觀察細(xì)胞骨架情況。提取總rna和總蛋白通過qrt-pcr和western-blot方法檢測(cè)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:mtt結(jié)果顯示wbv顯著促進(jìn)了成骨細(xì)胞在pti表面的增殖(p0.05);dapi染色和掃描電鏡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞在材料表面的附著數(shù)量和細(xì)胞偽足數(shù)量都顯著多于對(duì)照組;fitc細(xì)胞骨架熒光染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組pti表面粘附的細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組(p0.05),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可伸展出更多的微絲附著于pti表面(p0.05);qrt-pcr結(jié)果顯示wbv顯著上調(diào)了成骨相關(guān)基因和經(jīng)典wnt信號(hào)通路基因的表達(dá),western-blot結(jié)果顯示wbv顯著上調(diào)了成骨相關(guān)蛋白和經(jīng)典wnt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。結(jié)論:wbv刺激可以顯著加快pti內(nèi)部成骨細(xì)胞的增殖,提高成骨細(xì)胞在pti表面的粘附效果,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二:wbv協(xié)同pti對(duì)兔長(zhǎng)骨缺損修復(fù)的作用效果及機(jī)制研究方法:通過cad技術(shù)設(shè)計(jì)出多孔結(jié)構(gòu)的三維模型(6mm×8mm圓柱體,孔隙率約70%、孔隙直徑約1mm),導(dǎo)入3d打印系統(tǒng),通過電子束熔融技術(shù)將ti-6al-4v粉末逐層熔融凝固,制成pti材料,經(jīng)過超聲清洗、60co輻照滅菌后,作為實(shí)驗(yàn)用種植體。雌性新西蘭大耳白兔24只,體重3.0±0.4kg,肌肉注射3%戊巴比妥鈉溶液(1ml/kg)和鹽酸賽拉嗪注射液(0.1ml/kg)麻醉,在左側(cè)股骨外側(cè)髁位置制作深8mm,直徑6mm圓柱形骨缺損區(qū)域,填充pTi。術(shù)后1周,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重分為實(shí)驗(yàn)組(pTi+WBV)和對(duì)照組(pTi),實(shí)驗(yàn)組每天施加WBV(30Hz,0.5g)1h,對(duì)照組不做任何處理。分別在WBV刺激6周、12周后隨機(jī)對(duì)每組半數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材。取材前分兩次注射8%鈣黃綠素溶液(1ml/kg)。樣本進(jìn)行X線正、側(cè)位片檢查,Micro-CT檢查,熒光雙標(biāo)分析,Masson染色,qRT-PCR檢測(cè),甲苯胺藍(lán)染色。結(jié)果:X線正、側(cè)位片顯示骨缺損造模過程中pTi的種植位置正確;Micro-CT檢查結(jié)果顯示在6周、12周WBV刺激后,實(shí)驗(yàn)組pTi與骨組織整合情況要優(yōu)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組BV/TV、Tb.N均高于對(duì)照組(P0.05),BS/BV、Tb.Sp均低于對(duì)照組(P0.05);Masson染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組骨長(zhǎng)入情況優(yōu)于對(duì)照組;熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的礦化沉積率(MAR)、礦化面積比(MS/BS)和骨形成率(BFR/BS)均高于對(duì)照組;qRT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)過6周、12周WBV刺激,實(shí)驗(yàn)組成骨相關(guān)基因ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P0.05),Sost與RANKL基因表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P0.05),經(jīng)典Wnt信號(hào)通路基因Wnt3a,Lrp6和β-catenin均顯著高于對(duì)照組(P0.05);甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組。結(jié)論:WBV能夠提高pTi骨整合效果,改善pTi骨組織附著和長(zhǎng)入。在微觀層面上改善了骨組織和植入體的整合,從而改善骨缺損的修復(fù)效果,提高了pTi的穩(wěn)定性,避免了松動(dòng)和炎癥的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：全身振動(dòng)載荷 多孔鈦合金 成骨細(xì)胞 骨缺損
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R68
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-31
• 實(shí)驗(yàn)一 WBV對(duì)PTI中的兔原代成骨細(xì)胞行為和功能的影響及機(jī)制研究31-49
• 1 材料31-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材31
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器31-32
• 2 方法32-40
• 2.1 兔原代成骨細(xì)胞的提取32-33
• 2.2 成骨細(xì)胞的觀察和鑒定33-34
• 2.2.1 成骨細(xì)胞的鏡下觀察33
• 2.2.2 ALP染色33
• 2.2.3 茜素紅S染色33-34
• 2.3 三維pTi圓片的制作34
• 2.4 對(duì)成骨細(xì)胞施加WBV刺激34-35
• 2.5 WBV對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)的影響35-36
• 2.5.1 掃描電鏡下pTi表面成骨細(xì)胞的形態(tài)35-36
• 2.5.2 免疫熒光染色觀察pTi表面細(xì)胞形態(tài)36
• 2.6 WBV對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響36-37
• 2.7 WBV對(duì)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)信號(hào)通路的影響37-40
• 2.7.1 WBV對(duì)成骨相關(guān)基因的影響37-38
• 2.7.2 WBV對(duì)成骨相關(guān)蛋白的影響38-40
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析40
• 3.結(jié)果40-47
• 3.1 原代成骨細(xì)胞的提取40
• 3.2 原代成骨細(xì)胞的鑒定40-41
• 3.3 pTi圓片的制作結(jié)果41-42
• 3.4 WBV的施加效果42-43
• 3.5 WBV對(duì)成骨細(xì)胞粘附影響結(jié)果43-44
• 3.6 WBV刺激對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)影響結(jié)果44-45
• 3.7 WBV對(duì)pTi表面細(xì)胞增殖的影響結(jié)果45
• 3.8 WBV對(duì)成骨相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)的影響結(jié)果45-47
• 4 討論47-49
• 實(shí)驗(yàn)二 WBV協(xié)同PTI對(duì)兔長(zhǎng)骨缺損修復(fù)的作用效果及機(jī)制研究49-64
• 1 材料49-50
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物49
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材49
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑49-50
• 2 方法50-54
• 2.1 多孔結(jié)構(gòu)pTi的制備50
• 2.2 骨缺損動(dòng)物模型的制備50
• 2.3 WBV的施加及樣本處理50-52
• 2.4 取材及樣本處理52
• 2.5 Micro-CT檢查52
• 2.6 硬組織切片檢查52-53
• 2.7 Masson染色分析53
• 2.8 成骨相關(guān)基因檢查53
• 2.9 成骨細(xì)胞染色觀察53-54
• 2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析54
• 3 結(jié)果54-62
• 3.1 pTi種植體制作情況54
• 3.2 骨缺損造模結(jié)果54-55
• 3.3 樣本X線檢查結(jié)果55-56
• 3.4 Micro-CT檢查結(jié)果56-57
• 3.5 熒光雙標(biāo)檢查結(jié)果57-58
• 3.6 Masson染色結(jié)果58-59
• 3.7 qRT-PCR檢查結(jié)果59-61
• 3.8 骨小梁表面成骨細(xì)胞染色結(jié)果61-62
• 4 討論62-64
• 小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-82
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果82-84
• 致謝84

  本文關(guān)鍵詞：低強(qiáng)度振動(dòng)載荷協(xié)同多孔鈦合金對(duì)長(zhǎng)骨骨缺損修復(fù)的作用效果及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：426885