肌腱干細(xì)胞(TSPC)是肌腱組織工程與再生中的潛在種子細(xì)胞,但體外培養(yǎng)過程中TSPCs極易丟失表型�；谛》肿铀幬镆子诤铣�、保存和質(zhì)量控制的優(yōu)勢,本研究探索利用高通量篩選獲得用于TSPCs體外擴(kuò)增和表型維持的小分子化合物,建立穩(wěn)定培養(yǎng)體系。我們利用Scx GFP熒光可視化報(bào)告系統(tǒng)對(duì)FDA批準(zhǔn)的小分子庫和生物活性庫中的小分子進(jìn)行高通量篩選,獲得TSPCs表型維持的候選分子群,復(fù)篩進(jìn)一步驗(yàn)證陽性小分子。我們優(yōu)化每個(gè)分子的濃度,得到維持表型并啟動(dòng)腱系分化的最佳小分子組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子組合在維持表型的同時(shí)不能促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此,本課題進(jìn)一步通過高內(nèi)涵細(xì)胞分析篩選得到促進(jìn)細(xì)胞增殖的小分子。之后我們用單細(xì)胞分析手段進(jìn)行分化確認(rèn),并通過比較實(shí)驗(yàn)獲得腱系分化誘導(dǎo)的最佳小分子組合�；谝陨习l(fā)現(xiàn),我們建立了TSPCs分階段培養(yǎng)誘導(dǎo)策略,第一步利用小分子先促進(jìn)細(xì)胞增殖,第二步利用小分子組合進(jìn)行腱系分化誘導(dǎo),并進(jìn)一步結(jié)合生物相容性的水凝膠材料實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的應(yīng)用。我們通過3D打印技術(shù)將分階段誘導(dǎo)的活細(xì)胞與水凝膠結(jié)合在一起,在體內(nèi)促進(jìn)肌腱再生與修復(fù)。綜上所述,本課題建立了分階段誘導(dǎo)TSPCs分化的小分子策略,并結(jié)合...

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞
緒論
1 高通量篩選肌腱干細(xì)胞表型維持和體外擴(kuò)增的小分子及組合
    1.1 引言
    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        1.2.1 材料和試劑
        1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.2.3 試劑配制
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        1.3.1 TSPCs分離培養(yǎng)
        1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇
        1.3.3 細(xì)胞傳代
        1.3.4 細(xì)胞凍存
        1.3.5 DAPI染色
        1.3.6 高內(nèi)涵篩選
        1.3.7 細(xì)胞增殖檢測
        1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.4.1 肌腱干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中表型逐漸丟失
        1.4.2 初篩獲得六十種維持肌腱干細(xì)胞表型的小分子
        1.4.3 復(fù)篩獲得八種維持肌腱干細(xì)胞表型的小分子
        1.4.4 組合篩選獲得五種有效維持肌腱干細(xì)胞表型的小分子組合
        1.4.5 高通量篩選獲得六種促進(jìn)肌腱干細(xì)胞體外擴(kuò)增的小分子
    1.5 討論
2 高通量qPCR評(píng)估小分子及組合促進(jìn)肌腱干細(xì)胞體外擴(kuò)增和表型維持的效果
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        2.2.1 材料和試劑
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 試劑配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 cDNA制備
        2.3.2 引物設(shè)計(jì)
        2.3.3 BioMark上機(jī)
        2.3.4 其余方法同第一章
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 聚類分析顯示不同處理組間的基因差異
        2.4.2 主成分分析揭示四種細(xì)胞亞群
        2.4.3 分析各亞群特異表達(dá)的基因
        2.4.4 表型維持小分子及組合對(duì)關(guān)鍵腱系基因表達(dá)的影響
        2.4.5 促增殖小分子對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)的影響
    2.5 討論
3 建立肌腱干細(xì)胞表型維持及分階段腱系誘導(dǎo)策略
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        3.2.1 材料和試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 試劑配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 試劑盒提取RNA
        3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.3.3 細(xì)胞免疫熒光
        3.3.4 組織工程肌腱構(gòu)建
        3.3.5 HE染色
        3.3.6 Masson染色
        3.3.7 天狼星紅染色
        3.3.8 三系分化誘導(dǎo)
        3.3.9 ALP染色
        3.3.10 SO染色
        3.3.11 其余方法同第一、二章
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 五種小分子組合的效果比較
        3.4.2 確立促進(jìn)腱系分化的最佳小分子組合C1
        3.4.3 小分子組合C1的效果驗(yàn)證
        3.4.4 建立小分子分階段腱系誘導(dǎo)體系
    3.5 討論
4 小分子分階段腱系誘導(dǎo)策略結(jié)合水凝膠體系修復(fù)肌腱損傷
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        4.2.1 材料和試劑
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.3 試劑配制
        4.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 浸提液檢測膠體毒性
        4.3.2 掃描電鏡
        4.3.3 細(xì)胞骨架染色
        4.3.4 死活細(xì)胞染色
        4.3.5 皮下埋入動(dòng)物模型的建立
        4.3.6 髕腱缺損動(dòng)物模型的建立
        4.3.7 細(xì)胞追蹤C(jī)M-Dil染色
        4.3.8 膠體制備及3D打印
        4.3.9 組織學(xué)檢測
        4.3.10 組織免疫熒光
        4.3.11 Trizol法提取RNA
        4.3.12 透射電鏡
        4.3.13 膠原纖維直徑測量
        4.3.14 力學(xué)測試
        4.3.15 其余方法同第一、二、三章
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 Gel MA和 HA-NB復(fù)合水凝膠材料表征
        4.4.2 異位肌腱再生兩周后的效果評(píng)估
        4.4.3 異位肌腱再生四周后的效果評(píng)估
        4.4.4 原位肌腱修復(fù)兩周后的效果評(píng)估
        4.4.5 原位肌腱修復(fù)四周后的效果評(píng)估
    4.5 討論
5 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述 生物活性分子調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)用于肌腱再生
    參考文獻(xiàn)
作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果



本文編號(hào)：3751893