發(fā)布時間：2022-07-15 14:28

　　目的:通過構(gòu)建攜帶熱休克蛋白90α功能性F-5基因的慢病毒載體,并用慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞,來探索熱休克蛋白90α功能性F-5基因結(jié)合人臍帶間充質(zhì)干細胞對糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面的治療效果,并驗證其有效性,為治療糖尿病慢性創(chuàng)面提供新的有效的治療手段及方法,為臨床上應用休克蛋白90α功能性F-5基因表達產(chǎn)物治療糖尿病創(chuàng)面提供新的思路。方法:1、攜帶熱休克蛋白90αF-5基因的過表達慢病毒載體的制備、病毒包裝與滴度檢測:首先需要構(gòu)建攜帶目的基因的載體質(zhì)粒,可以選擇含有綠色熒光蛋白基因和抗藥物篩選基因的工具載體GV358,將事先經(jīng)過PCR擴增的目的基因片段交換入線性表達載體,并在感受態(tài)細胞中完成轉(zhuǎn)化,最終獲取質(zhì)粒。獲取質(zhì)粒后進行陽性克隆PCR鑒定,用以確定質(zhì)粒含有目的基因片段;并用蛋白印跡法檢測質(zhì)粒的目的基因是否能正常表達對應蛋白。上述制備好的工具載體質(zhì)粒GV358與輔助質(zhì)粒Helper1.0、Helper2.0一起,轉(zhuǎn)染293T細胞,完成病毒的包裝。通過反復離心的方式收獲病毒、濃縮純化病毒;并用通過觀察物理指標、滴度指標,對病毒質(zhì)量進行檢測。2、攜帶F-5基因慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞（... 

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
材料與方法
    第一部分 :攜帶熱休克蛋白90α“F-5”基因的過表達慢病毒載體的制備、病毒包裝與滴度檢測
        1.材料與設(shè)備
        2.攜帶熱休克蛋白90α功能性F-5基因的質(zhì)粒構(gòu)建
        3.蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測質(zhì)粒HSP90AA1 的表達
        4.慢病毒包裝
    第二部分 攜帶“F-5”基因慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)
        1.材料
        2.人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的培養(yǎng)、傳代及凍存
        3.慢病毒轉(zhuǎn)染后細胞相關(guān)指標測定
    第三部分 關(guān)于糖尿病創(chuàng)面愈合的動物實驗研究
        1.主要試劑和儀器
        2.實驗動物
        3.實驗方法
    第四部分 統(tǒng)計學分析
結(jié)果
    1.攜帶熱休克蛋白90α“F-5”基因的過表達慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.慢病毒包裝與滴度測定
    3.hUC-MSCs的特征
    4.慢病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs
    5.糖尿病大鼠外觀狀態(tài)觀察
    6.大鼠血糖的變化情況
    7.糖尿病大鼠創(chuàng)面模型外觀形態(tài)觀察
    8.創(chuàng)面愈合情況評估
    9.HE染色病理切片的觀察
    10.免疫組織化學染色法觀察創(chuàng)面組織VEGFR2、eNOS的表達情況
討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
    綜述參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
縮略詞表
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Recent advances on the association of apoptosis in chronic non healing diabetic wound[J]. Awadhesh K Arya,Richik Tripathi,Santosh Kumar,Kamlakar Tripathi.  World Journal of Diabetes. 2014(06)
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[3]人臍帶干細胞移植對大鼠糖尿病足及BDNF表達的影響[J]. 王瑛,周寧,王慶萍,金醒眆,侯宗柳,彭葆坤,但齊琴,王廷華.  四川大學學報(醫(yī)學版). 2013(06)
[4]Trends in prevalence of diabetes in Asian countries[J]. Ambady Ramachandran,Chamukuttan Snehalatha,Ananth Samith Shetty,Arun Nanditha.  World Journal of Diabetes. 2012(06)



本文編號：3662222